同一靶序列可以对应多条候选 siRNA，但若未进入胞质、在血清或内体中被核酸酶降解、或触发过强先天免疫反应，则观测不到期望的 mRNA 敲低。本篇从分子形态、化学修饰与递送载体三个层面建立名词与权衡直觉，不涉及具体试剂批次或品牌操作步骤。
段末注释：内体（endosome）为胞吞后膜泡结构，核酸常被困于内体需逃逸至胞质才易接触 RISC。
1. 分子形式：合成双链、shRNA 与 miRNA 工具
- 化学合成 siRNA：两条互补单链退火成双链，可直接转染；脱靶与浓度由序列与实验设计控制。
- 体外转录 dsRNA：长度常超出 siRNA 窗口，在哺乳动物细胞中易触发免疫，不等价于常规合成 siRNA 流程。
- 质粒 / 慢病毒 shRNA：DNA 编码茎环 RNA，在胞内由 Pol III 等转录后经 Dicer 加工进入 RNAi；适合稳定敲低与难转染细胞，但涉及载体生物安全与基因组整合风险（载体依赖）。
- miRNA mimic / inhibitor：分别模拟或竞争性抑制内源 miRNA 成熟体，作用网络常较 siRNA 多靶，解释表型时需区分机制。
2. 化学修饰：稳定性、活性与特异性
常见修饰位点包括 核糖 2’ 位 与 磷酸骨架。
| 修饰 | 直觉效果 | 可能代价 |
|---|---|---|
| 2’-O-甲基（2’-O-methyl，2’-O-Me） | 抗酶切、调节双链 Tm（melting temperature，解链温度） | 过量可降低活性 |
| 2’-F | 提升结合亲和力、RNase 耐受 | 设计不当影响装载 |
| 锁核酸（locked nucleic acid，LNA） | 强结合、短序列即可高 Tm | 成本与毒性窗口需关注 |
| 硫代磷酸（phosphorothioate，PS） | 抗外切酶 | 非特异性蛋白结合、肝摄取 |
| 乙烯基磷酸酯（vinyl phosphonate，VP）等 | 代谢稳定性策略之一 | 属药物化学范畴 |
修饰与 off-target（脱靶）谱、免疫原性并非独立：「更稳定」并不自动等于「更安全」。
3. 递送：脂质、LNP 与 GalNAc 偶联
- 阳离子脂质 / 脂质体：压缩带负电 RNA，促进胞吞；常需辅助逃逸内体的可电离脂质组分。
- 脂质纳米粒（lipid nanoparticle，LNP）：mRNA 疫苗平台已普及 LNP 概念；siRNA 药物亦广泛采用 LNP 包载。
- GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）偶联：利用肝细胞去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）介导的高效肝摄取，适用于肝靶基因沉默药物。
段末注释：ASGPR 为肝细胞表面富集的内吞受体家族。
4. 先天免疫识别：TLR3、TLR7/8 与序列组成
Toll 样受体 3（TLR3）识别内体中的长 dsRNA；TLR7/TLR8 识别单链 RNA 中富含 U 的片段。未修饰或富含特定基序的 siRNA 可能在 pH 较低的内体环境中被 TLR 感知，诱导 I 型干扰素（type I interferon）等炎症因子，表现为细胞状态改变或细胞死亡，与「敲低失败」或假阴性/假阳性混淆。U 富集与 GU 连续等经验规则在序列设计阶段会与免疫刺激性一并考量。
5. 体内 vs 体外
血清与组织中存在 RNase；siRNA 经肾清除与蛋白结合亦影响半衰期。体内实验通常比体外转染需要更强修饰或载体，且组织选择性仍是瓶颈。