微 RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约 21–23 核苷酸（nucleotide，nt）的内源性单链 非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA），在真核生物中广泛参与转录后基因调控（post-transcriptional gene regulation）。成熟 miRNA 装载入 RNA 诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），通过碱基配对识别靶 信使 RNA（messenger RNA，mRNA），导致翻译抑制和/或 mRNA 降解。外泌体携带的 miRNA 正是这一调控体系在细胞外空间的延伸载体；理解其生物发生与作用规则，是解读测序结果的前提。
段末注释：RISC 以 AGO（Argonaute）蛋白为核心，装载小 RNA 引导链并执行沉默效应。
读前说明
- 本文聚焦经典动物 miRNA 通路（Pol II → Drosha/Dicer → AGO2）；植物 miRNA 与部分 mirtron 旁路不在展开范围，仅在边界处点名。
- 长度、配对能量等 occasionally 用 $L$ 表示序列长度、$\Delta G$ 表示杂交自由能；下文以生物学描述为主。
- 配图位于同名目录
miRNA-01-生物学背景/；站点开启post_asset_folder时正文图链仅写文件名。 - 与 siRNA 系列的交叉阅读：
siRNA-00-前置知识-02-ncRNA系统综述§3.1、siRNA-01-生物学机制与功能原理。
1. 发现与定义
1.1 历史脉络
miRNA 的发现可追溯至 1993 年 lin-4 对 C. elegans 发育时序的调控：一个 ~22 nt 的 RNA 通过与 lin-14 mRNA 3’ 非翻译区（3’ untranslated region，3’ UTR）配对抑制其表达。此后 let-7 在多种动物中保守存在，表明 miRNA 是演化上古老的调控模块。高通量克隆与 RNA 测序（RNA sequencing，RNA-seq）时代，人类基因组已注释数千条 miRNA 基因（miRBase 等数据库持续更新）。
1.2 分子定义
成熟 miRNA 的典型特征：
| 特征 | 典型值 / 描述 |
|---|---|
| 长度 | ~21–23 nt（成熟体）；前体 pre-miRNA ~60–70 nt 发夹 |
| 来源 | 基因组 DNA 转录，经加工而非直接来自 tRNA/rRNA 随机降解 |
| 结构前体 | pri-miRNA（初级转录本）→ 发夹 pre-miRNA |
| 效应器 | AGO 蛋白家族，哺乳动物胞质 miRNA 以 AGO2 为主 |
| 靶标 | 多数为 mRNA 3’ UTR；亦可见 5’ UTR、编码区 |
段末注释：3’ UTR 为 mRNA 终止密码子下游、不翻译成蛋白的区段，富含 miRNA 结合位点。
2. 生物发生通路
图 1 概括从转录到效应复合体装配的主路径；各步骤的分子机器与亚细胞定位如下。
2.1 转录：pri-miRNA
多数 miRNA 基因由 RNA 聚合酶 II（RNA polymerase II，Pol II）转录，产物为带 5’ 帽（cap）与 poly(A) 尾的 pri-miRNA，可长达数千 nt，常含内含子——与 mRNA 转录机器共享部分加工环境。部分 miRNA 位于 内含子（mirtron）或 tRNA/snoRNA 宿主转录本中，可绕过 Drosha 步骤。
2.2 核内加工：Microprocessor
pri-miRNA 在核内被 微处理器（Microprocessor）复合体切割：Drosha（RNase III 家族）与 DGCR8（dsRNA 结合蛋白）识别发夹茎环结构，释放 pre-miRNA（~60–70 nt）。发夹末端 2 nt 3’ 突出端（overhang）是后续 Exportin-5/RanGTP 核输出的识别特征。
2.3 胞质加工：Dicer
pre-miRNA 在胞质被 Dicer（与 TRBP/PACT 等辅助因子）切成 ~22 bp 双链 miRNA/miRNA*（引导链/乘客链，star strand）。Dicer 同样参与 siRNA 双链的产生，是 miRNA 与外源 siRNA 通路的汇合点。
2.4 RISC 装载与链选择
双链的一条链（引导链，guide strand）被 AGO2 保留，另一条（*链 或 passenger）被解旋并降解。链选择受双链两端热力学不对称性影响：5’ 端配对较弱的一端更易进入 AGO PAZ 结构域。成熟 RISC 含 AGO2、TNRC6（GW182）等，定位胞质 P-body 与应激颗粒附近。
段末注释：PAZ 为 AGO 蛋白结合小 RNA 3’ 端的结构域；链选择规则对外源 siRNA 设计同样重要。
3. 靶标识别与调控模式
3.1 种子区（seed region）
miRNA 与靶 mRNA 的配对以 5’ 端第 2–8 nt 为核心，称为种子区（seed region）。种子完全或近乎完全配对是高效沉默的常见条件；中央区（positions 9–12）配对可触发 AGO2 的切片酶（slicer）活性，导致靶 mRNA 在中位点附近断裂。
配对强度可粗略写为：
$$
\Delta G_{\mathrm{hybrid}} = \Delta G_{\mathrm{seed}} + \Delta G_{\mathrm{supplementary}} + \Delta G_{\mathrm{loop/ bulge}}
$$
实践中常用靶标预测工具（TargetScan、miRanda 等）对种子匹配与上下文特征（AU 富集、位点保守性）加权，而非仅计算全链 $\Delta G$。
3.2 翻译抑制与 mRNA 降解
miRNA 介导的沉默包括：
- 翻译抑制：RISC 招募 CCR4-NOT、PAN2-PAN3 等 deadenylase，缩短 poly(A) 尾；或抑制 eIF4F 依赖的翻译起始。
- mRNA 降解：去腺苷酸化后 5’→3’ 或 3’→5’ 外切酶降解；高互补配对时 AGO2 直接切割 mRNA。
- 转录调控（核内 miRNA）：部分 miRNA 在核内与 AGO 参与异染色质建立，哺乳动物中比例较低。
与 siRNA 相比，miRNA 更常见不完全配对与翻译抑制；siRNA 设计目标多为近乎全链互补的高效切割。
3.3 一个 miRNA，多个靶标
单个 miRNA 可调控数百个 mRNA（多效性，pleiotropy）；单个 mRNA 3’ UTR 亦可容纳多个 miRNA 位点（组合调控）。因此外泌体 miRNA 谱变化反映的是调控网络层面的信号，而非单基因读出。
4. 序列变异与异构体
4.1 miRNA 家族
miRNA 常成家族（family）：种子区相同或高度相似的不同 miRNA 基因（如 let-7 家族）调控重叠靶标集。测序注释时需区分 成熟体名称（如 hsa-miR-21-5p）与前体（hsa-mir-21）。
4.2 isomiR
成熟 miRNA 可在 5’ 或 3’ 端相对参考序列偏移 1–3 nt，或发生 腺苷酸化（tailing），统称 异构体（isomiR，isomiR）。sRNA-seq 中 isomiR 可占某 miRNA 读段的大多数；定量时需在「合并为成熟体」与「保留 isomiR 分辨率」之间明确策略。
4.3 5p / 3p 臂
发夹 pre-miRNA 的两条臂均可产生成熟体，命名如 miR-X-5p 与 miR-X-3p；不同细胞类型或条件下主导臂可切换，外泌体与胞内比例亦可能不同。
5. 与 siRNA、endo-siRNA 的边界
| 维度 | miRNA | siRNA（外源/设计） | endo-siRNA |
|---|---|---|---|
| 来源 | 内源发夹基因 | 合成双链 / shRNA 表达 | 双链 RNA 底物（重复元件等） |
| 加工 | Drosha + Dicer | 主要 Dicer | Dicer |
| 配对要求 | 种子为主，常不完全 | 强调全链互补 | 介于两者之间 |
| 主要效应 | 翻译抑制 + 降解 | mRNA 切割 | 转座子抑制等 |
| 典型应用 | 生物标志物、疾病机制 | 药物、功能缺失 | 生殖系、病毒防御 |
外泌体 miRNA-seq 质控中若出现大量**非 miRNA 的小 RNA 或异常 siRNA 样双链信号，需考虑样本污染、文库偏好或 RNA 降解，而非单纯「靶基因下调」。
6. 检测与数据库
| 资源 | 用途 |
|---|---|
| miRBase | 成熟体、发夹序列与命名 |
| TargetScan / miRTarBase | 靶标预测与实验验证汇总 |
| AGO2 CLIP-seq | 体内结合位点 |
| qPCR（TaqMan/SYBR） | 单 miRNA 验证 |
| sRNA-seq | 全谱定量、isomiR、新 miRNA 发现 |
液体活检与外泌体研究中，sRNA-seq 提供全景，qPCR 用于关键 miRNA 的独立验证；二者关注的长度窗口与归一化策略不同，不可直接混用绝对拷贝数。
小结
- miRNA 是 ~22 nt 内源小 RNA，经 Drosha/Dicer 加工后载入 AGO2-RISC，以种子区识别靶 mRNA。
- 调控以翻译抑制与 mRNA 降解为主，具有多靶标网络特征；isomiR 与 5p/3p 臂使测序定量需预先约定注释粒度。
- 与 siRNA 共享 Dicer/AGO 机器但配对规则与生物学来源不同；外泌体 miRNA 分析应在外源 siRNA 干扰实验与内源谱之间分清语境。
- 下一篇将讨论 miRNA 如何进入外泌体并在细胞间传递，衔接「为何用 miRNA-seq 评估外泌体质量」。
段末注释：CLIP-seq（cross-linking immunoprecipitation sequencing）为紫外交联后免疫沉淀 AGO 结合 RNA 并测序的方法，用于实验验证 miRNA 靶标。