miRNA-06.外泌体转录组分析平台

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外泌体转录组（以 sRNA-seq/miRNA-seq 为核心）分析平台的模块划分、标准流程、各步骤要解决的问题、主流工具、技术难点与交付物；兼及可选 mRNA 片段分析。

外泌体转录组分析平台，服务的是外泌体 RNA 内容物的测序数据——在本系列课题中，核心是 small RNA 测序（small RNA sequencing，sRNA-seq）/miRNA-seq，目标不仅是「数 read」，更要回答：这份外泌体样品在 RNA 层面是否合格、谱是否像预期、能否进入下游比较分析。

平台总览与多组学关系见 miRNA-05-外泌体多组学生物信息分析平台概览；QC 指标判读逻辑详见 miRNA-03-测序分析与外泌体质控；模块开发估时见 miRNA-04 §2；分阶段落地计划（先转录组）见 miRNA-14 §4。

段末注释：sRNA-seq 针对 ~18–40 nt 小 RNA 建库；与全转录组 mRNA-seq 的读长分布与分析流程不同，不可混用同一套默认参数。

图 1　外泌体转录组分析平台框架

图 1 主链路：数据接入 → FASTQ QC → 比对定量 → 污染分析 → 签名 QC → 归一化 → QC 报告；报告放行后进入差异 miRNA 与靶基因富集；T11 签名库、T12 蛋白组关联为扩展模块。

1. 平台定位与边界

项目 说明
主场景 外泌体/EV 馏分 miRNA 质控与表达谱分析
主输入 FASTQ（单端或双端，依建库）
主输出 QC 报告、miRNA 计数/归一化矩阵、（可选）差异 miRNA 列表
不做 替代实验分离；不单独凭 NTA 判合格（需与 miRNA-07 及物理指标联合）
可选扩展 外泌体 mRNA/lncRNA 短片段 RNA-seq（二期）

2. 外泌体方向：核心问题与评估维度

外泌体转录组平台的首要任务不是「跑出差异 miRNA」，而是依次回答下面两类问题（与 miRNA-03 一致）：

  • 技术质控：测序数据本身是否可靠？
  • 生物学质控：样品是否符合外泌体 miRNA 的预期特征？

图 2　外泌体转录组核心评估问题

图 2 概括平台必须评估的七个维度；下表对应平台模块与典型指标。

维度 核心问题 典型指标 / 动作 对应模块
① 技术质控 文库是否成功、读段是否可用？ 读长 21–23 nt 主峰；接头比例；深度；重复率 T2
② miRNA 富集 有效读段是否 mainly miRNA？ miRNA mapping rate（对照实验室基线） T3、T4
③ RNA 纯度 有无细胞裂解 / 游离 RNA 污染？ rRNA%、tRNA/tRF%、mRNA 片段% T4
④ 来源一致性 谱是否像「预期的外泌体 cargo」？ Top miRNA 排名；与参考批相关；PCA 聚类 T5、T11
⑤ 体液干扰 血浆/培养体系特有污染？ miR-451a（溶血）、miR-223（血小板）；FBS 对照谱 T5
⑥ 批次可比 能否跨样品/批次比较？ 技术重复相关；归一化（RPM/DESeq2）；批次监控 T6
⑦ 分析放行 能否进入差异与标志物分析？ QC 报告标签：合格 / 边缘 / 不合格 T10

段末注释：阈值（如 miRNA% >50%）须在本实验室合格批次上校准，不宜跨项目硬套；边缘样品需人工复核后再放行下游。

3. 平台模块地图

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[T1 数据接入] → [T2 FASTQ QC] → [T3 比对定量] → [T4 污染分析]
                                        ↓
              [T10 QC 报告] ← [T6 归一化/批次] ← [T5 签名 QC]
                    ↓
         （放行后）[T7 差异] → [T8 靶基因/富集]
                    ↓
              [T11 签名库]     [T12 蛋白组关联]
模块 名称 优先级
T1 原始数据接入与元数据校验 P0
T2 FASTQ 预处理与读段层 QC P0
T3 比对注释与 miRNA 定量 P0
T4 污染 RNA 组成分析 P0
T5 外泌体 miRNA 签名 / 参考谱 QC P0
T6 归一化、批次与重复性 P0
T7 差异 miRNA 分析 P1
T8 靶基因预测与通路富集 P1
T9 mRNA/lncRNA 片段（可选） P2
T10 自动化 QC 报告与合格判定 P0
T11 参考签名库与对照管理 P1
T12 与蛋白组多组学关联 P1

4. 标准分析流水线

3.1 流程总览

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原始 FASTQ
  → 接头修剪 / 长度过滤（15–35 nt）
  → 质量过滤 / 去重复（可选 UMI）
  → 分层比对（miRBase + rRNA + tRNA + 宿主基因组）
  → miRNA 计数（成熟体默认；可选 isomiR / 5p/3p）
  → 组成比例 + 签名 QC + 归一化
  → QC 报告 /（放行）差异与富集

3.2 与 miRNA-03 的字段对齐

QC 报告必含字段（与 miRNA-03 §7 一致）：

  1. 总读段、修剪后读段、读长分布图
  2. miRNA%、rRNA%、tRNA%、未比对%
  3. Top 20 miRNA 及与参考批次对比
  4. PCA / 相关性（含对照）
  5. 溶血/血小板相关 miRNA
  6. 重复一致性
  7. 结论标签：合格 / 边缘 / 不合格

5. 核心模块详解

T1　数据接入与元数据

项目 内容
要解决的问题 测序文件与样本错配；缺物种、分离方法、对照类型
主流方法 样本表模板 + MD5 校验；对照标签（PBS、EV-depleted、裂解物）
技术难点 多中心命名不一；sRNA-seq 与 mRNA-seq 误投递
平台交付 校验失败则阻断下游；元数据写入报告页眉

T2　FASTQ 预处理与读段 QC

项目 内容
要解决的问题 接头、低质量、非 miRNA 长度窗口污染
主流方法 fastp / cutadapt；FastQC + MultiQC
技术难点 试剂盒接头差异；极低起始 RNA → 高 PCR 重复
关键判读 21–23 nt 主峰；主峰缺失 → 生物学 QC 降级（见 miRNA-03 §2.1）

T3　比对与 miRNA 定量

项目 内容
要解决的问题 读段归属到成熟 miRNA；生成计数矩阵
主流方法 bowtie/STAR + miRBase；miRDeep2 流程
技术难点 近源 miRNA 家族歧义；isomiR 与成熟体口径统一
默认策略 质控与差异均用成熟体合并；isomiR 仅 QC 附录

T4　污染 RNA 分析

项目 内容
要解决的问题 区分囊泡 miRNA vs 泄漏 rRNA/tRNA/mRNA
主流方法 多库分层比对 + 占比图
技术难点 tRF/tiRNA 与 miRNA 边界；血浆背景复杂
外泌体期望 miRNA ↑，rRNA/tRNA ↓（相对游离 RNA 或裂解对照）

T5　签名与参考谱 QC

项目 内容
要解决的问题 谱是否与供体细胞/历史合格批一致；溶血、FBS、血小板干扰
主流方法 Top N 条形图；Pearson/Spearman；PCA；miR-451a、miR-223-3p 等监控
技术难点 无通用金标准 miRNA 列表；须实验室自建参考库（→ T11）
判定 规则写入 SOP，报告引用 SOP 版本

T6　归一化与批次

项目 内容
要解决的问题 文库深度与批次导致不可比
主流方法 组成 QC 用 RPM/CPM；差异用 DESeq2/edgeR
技术难点 血浆内参争议；ComBat 不用于最终 QC 合格判定
重复性 技术重复相关性纳入 T10

T10　自动化 QC 报告

项目 内容
要解决的问题 手工拼图不可审计、不可 scale
主流方法 MultiQC + 定制 HTML/PDF
平台行为 自动打标签；边缘样品触发人工复核工作流

6. 标准版分析能力（Phase 2）

T7　差异 miRNA

项目 内容
要解决的问题 组间哪些 miRNA 显著变化
主流方法 DESeq2 / edgeR；FDR 校正；火山图/热图
前提 n≥3 生物学重复；样品已通过或经确认之 QC
技术难点 外泌体 RNA 量少 → 重复不足；离群样品敏感

T8　靶基因与富集

项目 内容
要解决的问题 差异 miRNA 的靶与通路
主流方法 TargetScan / miRTarBase；clusterProfiler GO/KEGG
技术难点 预测假阳性；分泌态 miRNA 与胞内靶网络不完全等同

7. 扩展模块

T9　mRNA / lncRNA 片段（可选）

部分项目需评估 EV 中长 RNA 降解片段；流程接近 RNA-seq 但解读独立。建议二期，与 sRNA-seq 双流程维护成本较高。

T11　参考签名库

存储合格批次归一化 miRNA 矩阵，按「细胞系 × 分离方法 × 试剂批」版本化；新项目自动相似度比对。

T12　与蛋白组关联

与 miRNA-07 P11 共用样品 ID；miRNA-靶-蛋白三角 + 联合报告章节。

8. 常见失败模式（平台内置提示）

现象 平台提示 建议动作
miRNA% 极低 污染 RNA 条高亮 回溯分离 SOP
miR-451 极高 溶血标志 重新采血
与 FBS 对照谱相似 血清 EV 背景 EV-depleted FBS
读长 <18 nt 为主 降解/建库失败 重做 RNA 提取或建库

完整表见 miRNA-03 §8。

9. 工具栈参考

步骤 常用工具
预处理 fastp, cutadapt
QC 汇总 FastQC, MultiQC
比对 bowtie, STAR
注释/定量 miRDeep2, 自研计数脚本
统计 R, DESeq2, edgeR
富集 clusterProfiler
编排（规划） Nextflow / Snakemake / WDL

10. 开发分期（摘要）

阶段 模块 能力
MVP T1–T6 + T10 外泌体 miRNA QC 闭环
标准 + T7 + T8 组间差异与通路
完整 + T11 + T12 签名库 + 多组学

详细人周见 miRNA-04 §2.2。

小结

  • 外泌体转录组平台的第一性目标是 miRNA 层面的技术 QC + 生物学 QC，落实 miRNA-03 全部关键指标。
  • 流水线：预处理 → 分层比对 → 定量 → 签名/污染 QC → 报告；通过后方可进入差异与富集。
  • 与蛋白组、物理指标的联合判读在 miRNA-05 §5 统一调度。
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