miRNA-08.蛋白质组学实验与数据分析入门

如果你熟悉 Western（看几个蛋白）或 RNA-seq（看基因表达），但从未做过蛋白质组学（proteomics），第一次听到「搜库」「LFQ」「FDR」往往会一头雾水。本文从零开始，把实验在做什么、计算机在算什么串成一条线；外泌体场景下的 QC 要点见 miRNA-07-外泌体蛋白组分析平台。

段末注释：蛋白质组学指一次性检测样品中大量蛋白的鉴定与（通常还有）定量；本系列实验端以 液相色谱-质谱（liquid chromatography–mass spectrometry，LC-MS/MS）路线为主。

读前说明

不涉及具体仪器按钮怎么按、试剂盒怎么加——那是实验 SOP；这里帮你建立整体地图。
配图位于 miRNA-08-蛋白质组学实验与数据分析入门/。
有 R / Python 或 NGS 经验会更容易上手分析端，但不是硬性前提。

1. 一句话：蛋白质组学在干什么？

可以把细胞或外泌体里的蛋白混合液，想象成一本超厚的合订本：

Western 像只翻其中几页，确认「这几段在不在」；
蛋白质组学 像尽量把整本书的目录列出来，并常常还要比较「这本书比那本厚/薄多少」。

实验负责把蛋白变成质谱能「读」的信号；分析负责把信号翻译回「这是哪个蛋白、含量大概多少」。

图 1　蛋白质组学实验与数据分析全流程（入门示意）

图 1 上半是实验，下半是分析；后文按此顺序展开。

2. 和 RNA-seq、Western 怎么区分？

方法	看什么	通量	通俗理解
Western	少数几个蛋白	很低	点名检查
RNA-seq	基因转录本丰度	很高	看「生产计划单」
蛋白质组	蛋白本身	高（通常几千蛋白）	看「成品仓库现货」

重要直觉：mRNA 多 ≠ 蛋白一定多（翻译、降解、修饰都会影响）。所以外泌体项目里 miRNA-seq 与蛋白组是互补的，不能互相替代——见 miRNA-05 §5 联合 QC。

3. 实验端：从样品到质谱

3.1 样品从哪来？

常见起点：

细胞裂解液（全细胞蛋白）；
外泌体 / EV 馏分（蛋白量少，但更有针对性）；
血浆/血清（蛋白极多，动态范围大，难度高）。

外泌体样品往往总蛋白很少，后面鉴定数会比全细胞低——这不一定是失败，但解读时要心里有数。

3.2 蛋白提取与浓度测定

目标：把蛋白从样品里溶出来，并知道大概有多少。

常用 BCA / Bradford 测浓度；
外泌体样品切忌「浓度假设」——宁可统一上样量规则，也要记录实际测值。

3.3 酶切：把长蛋白剪成短肽段

质谱不适合直接测整条大蛋白，通常先用蛋白酶（最常见 胰蛋白酶 trypsin）把蛋白剪成肽段（peptide，像把长文章切成短句）。

这一步叫 酶切消化（digestion）。剪完得到的是肽段混合物，不是单个蛋白了——后面要靠算法把肽段拼回蛋白。

3.4 液相色谱（LC）：先排队，再一个一个进质谱

肽段太多，若一次性全塞进质谱会「糊成一片」。液相色谱像传送带：按时间把肽段一个一个送进质谱仪。

你可以把它理解成：先分离，再检测。

3.5 质谱（MS/MS）：给肽段称重量、读序列

质谱仪做两件核心事：

测质量（m/z，质荷比）——像给每个肽段称「分子量」；
二级质谱（MS2） 把肽段再碎一点，根据碎片模式推断氨基酸序列。

实验员最后得到的是大量 .raw / mzML 等原始谱图文件——像一堆「只有仪器能直接读的天书」。

3.6 实验端小结（检查清单）

步骤	初学者应记住
样品	记录来源、处理、批次
提取 & 定量	浓度与上样量影响鉴定深度
酶切	蛋白 → 肽段
LC-MS/MS	分离 + 测序列与强度
产出	原始谱图 → 交给分析（搜库）

4. 分析端：从「天书」到「蛋白表」

生物信息分析通常不在你的笔记本上跑质谱，而是对实验产生的谱图做搜库与统计。主流软件：MaxQuant、FragPipe（含 MSFragger）、Proteome Discoverer 等。

4.1 搜库：谱图和数据库对答案

实验室测到的是「未知肽段指纹」；计算机里有一个蛋白序列数据库（如人类 UniProt），里面是所有已知蛋白的理论序列。

搜库（database search）就是：把每个实验谱图和数据库里「理论酶切肽段」比对，找最像的匹配。

输出通常是：

鉴定到了哪些肽段；
这些肽段属于哪些蛋白；
每个谱图/肽段的打分。

4.2 FDR：控制「认错」的比例

数据库很大，随机也可能碰对几个肽段。所以要控制假发现率（false discovery rate，FDR）。

初学者只需记住：

报告里写 FDR ≤ 1%，表示大约 100 个鉴定里允许 ~1 个可能是错的（统计意义下的控制）；
别为了「鉴定数好看」把 FDR 放得过松。

段末注释：FDR 是多重检验校正后的错误比例估计，与单个肽段的「打分」不是同一概念。

4.3 定量：这个蛋白有多「多」？

鉴定回答「有没有」；定量回答「多少」。

常见策略（无标记）：

方法	白话
LFQ（label-free quantification）	用谱图峰强度估计蛋白相对丰度，MaxQuant 最常用
iBAQ	粗略估计绝对量，更适合看组成比例，不宜单独做差异
DIA	另一种采集模式 + 另一套算法，通量高，入门先知道名字即可

你会拿到一张大表：行 = 蛋白，列 = 样品，格 = 强度或 LFQ 值。这就是下游统计的输入。

4.4 过滤与归一化：让样品可以比

原始矩阵不能直接用，常见要做：

过滤：去掉只出现在 1 个样品里的蛋白、去掉鉴定太弱的；
缺失值处理：没测到的格子是「真的不存在」还是「太稀没扫到」？外泌体低丰度样品缺失很常见；
归一化：不同样品上样量、仪器响应不同，要拉到同一尺度（如中位数归一化）。

这一步搞错了，后面差异分析全白做。

4.5 差异蛋白分析：哪几个变了？

有分组（如处理 vs 对照、疾病 vs 健康）时，对每个蛋白做统计检验：

常用 limma、MSstats 等；
得到 p 值，再做 FDR 校正；
画火山图（横轴变化倍数，纵轴显著性）。

初学者易犯错误：重复太少（1–2 个生物学重复很难下结论）、把技术重复当生物学重复。

4.6 富集分析：变化的蛋白在干什么？

差异蛋白一长串，人眼看不懂。富集（enrichment）回答：这些蛋白是不是在某个通路里扎堆？

GO（gene ontology）：生物过程、细胞定位、分子功能；
KEGG / Reactome：通路图。

工具如 clusterProfiler、DAVID。注意：鉴定数少时，富集结果可能「看起来很美但 power 不足」。

4.7 分析端小结

原始谱图
  → 搜库（MaxQuant / FragPipe …）
  → FDR 过滤
  → 蛋白 × 样品 定量矩阵
  → 过滤 / 归一化 /（谨慎）插补缺失
  → 差异分析
  → GO / KEGG 富集
  → 图 + 表 + 文字报告

5. 外泌体蛋白组：多记三件事

做外泌体而不是全细胞时，在通用流程上额外关注：

5.1 样品身份：真的是 EV 吗？

看经典标志蛋白是否出现：CD63、CD9、CD81、TSG101 等（详见 miRNA-07 §2）。没有单一蛋白能一锤定音，需结合粒径、Western、miRNA 谱。

5.2 污染：杂质蛋白会「喧宾夺主」

血浆：白蛋白、载脂蛋白 极 abundant；
实验：角蛋白（keratin，来自皮肤、 dust）；
制备：核蛋白 升高提示细胞裂解污染。

分析时要会用污染蛋白列表过滤，并保留过滤前后对照。

5.3 和 miRNA 组学对表

同一批外泌体，若同时测了 sRNA-seq，应在样品 ID 层面对齐，看蛋白 QC 与 miRNA QC 是否一致——见 miRNA-07 图 2。

6. 初学者常见困惑（FAQ）

Q1：鉴定到 500 个蛋白算少吗？
取决于样品类型。外泌体 500 可能正常；全细胞裂解往往上千。要和同实验室历史数据比，不要死记网上的数字。

Q2：搜库一定要自己会吗？
入门阶段可以由质谱核心平台跑 MaxQuant 交付 proteinGroups.txt；你需要懂的是矩阵里每列含义和下游 QC，再逐步学搜库参数。

Q3：LFQ 缺失很多怎么办？
外泌体常见。别随便用 0 填缺失做 t 检验；先问实验能否加量、加重复，再选合适的过滤和统计方法（如 MSstats）。

Q4：差异蛋白和 Western 对不上？
Western 看单个、更敏感；组学有 FDR 阈值、定量误差。选 2–3 个关键蛋白做 Western 验证是常见做法。

Q5：和转录组差异基因列表怎么联合？
蛋白 ↔ 基因需名称映射（UniProt ↔ Gene symbol）；注意 mRNA–蛋白不同步。外泌体项目优先做样品级 QC 是否一致，再谈联合通路。

7. 推荐学习路径

阶段	建议
第 1 周	读本文 + miRNA-07 图 1–2；搞清实验/分析分工
第 2–3 周	拿一份 MaxQuant 输出的 `proteinGroups.txt`，在 Excel / R 里看列名、筛 LFQ、画简单箱线图
第 4 周起	学 limma 或 MSstats 做差异；clusterProfiler 做 GO
结合项目	对照 miRNA-04 §3 看平台要自动化的模块

公开教程关键词：MaxQuant tutorial、FragPipe wiki、MSstats vignette、ProteomicsML 示例数据。

小结

实验：蛋白提取 → 酶切成肽段 → LC 分离 → MS/MS 测序列与强度 → 原始谱图。
分析：搜库 → FDR → 定量矩阵 → 归一化 → 差异 → 富集 → 报告。
外泌体：额外盯 EV 标志蛋白、污染蛋白、与 miRNA 及物理 QC 的三角验证。
入门先建立全局地图，再深入某一个软件；与系列平台文档衔接见 miRNA-07。

后续可扩展：基于 MaxQuant 输出的 hands-on 练习 notebook（待补）。