miRNA-13.生物药研发中的分子功能与生物表征

在生物药（biopharmaceutical）研发项目计划、CMC（chemistry, manufacturing, and controls，化学、生产与控制）方案或监管申报材料中，生物表征与分子功能是两条并行、又时常交叉的分析主线：前者回答「产品是什么、够不够纯、批次间是否一致」；后者回答「它在分子与细胞层面做什么、机制是否成立、活性是否可重复」。对外泌体/细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）先进治疗产品而言，这一区分直接对应 miRNA-11 中的身份 / cargo / 效价三分法，也与 MISEV2023 的表征章与功能章相衔接。

段末注释：CMC 涵盖原料药与制剂的生产工艺、质量控制与稳定性；效价（potency）指与预期生物学/临床效应相关的定量活性测定。

读前导航：外泌体场景化评估见 miRNA-11 §5；实验报告规范见 miRNA-12；转录组/蛋白组平台模块见 miRNA-06、miRNA-07；本文 §3–§5 概括生物表征中组学一般关注哪些分析内容。

配图位于 miRNA-13-生物药研发中的分子功能与生物表征/。

1. 两个概念各回答什么问题

维度	生物表征（Biological / Biophysical-biochemical Characterization）	分子功能（Molecular Function / Mechanistic Function）
核心问题	身份、结构、纯度、杂质、稳定性	靶点结合、信号通路、细胞效应、效价
监管逻辑	ICH Q6B 表征精神；支撑质量标准（specification）与变更可比性	作用机制（mechanism of action，MOA）；生物学活性/效价检测；非临床药效支撑
典型产出	产品画像、关键质量属性（critical quality attribute，CQA）清单、放行检测项	剂量–效应曲线、机制归因实验、与临床终点挂钩的 potency assay
失败含义	「不是同一类产品」或「杂质不可接受」	「机制不成立」或「活性不足/不可重复」

图 1　生物表征与分子功能在研发链条中的位置

图 1 左：生物表征侧重「画清楚产品」；右：分子功能侧重「讲清楚、量清楚作用」；二者在 CMC 阶段汇合为批次放行与货架期管理。

2. 生物表征包含哪些内容

生物表征是对原料药/制剂的理化–结构–纯度–稳定性的系统描述，目标是建立可写入质量标准的可重复、可定量检测体系。按层次可拆为六块。

2.1 身份与结构（Identity & Structure）

内容	常用手段	备注
一级结构	测序、肽图、质谱	氨基酸/核苷酸序列确认
高级结构	CD、HDX-MS、晶体学	二级/三级/四级结构
翻译后修饰（PTM）	糖谱、质谱	糖基化、氧化、脱酰胺、磷酸化等
二硫键/游离巯基	LC-MS、Ellman	氧化还原状态

2.2 理化性质（Physicochemical）

分子量、等电点（pI）、消光系数；
粒径、多分散性（polydispersity index，PDI）、ζ 电位——纳米制剂与 EV 必报（miRNA-11 §5.1）；
溶解度、黏度、渗透压、pH。

2.3 纯度与杂质（Purity & Impurities）

类别	典型指标	常见方法
产品相关	聚集体、片段、异构体	SEC-HPLC、AUC、CE-SDS
工艺相关	宿主细胞蛋白（HCP）、宿主 DNA	ELISA、qPCR
安全相关	内毒素、支原体、无菌	LAL、PCR、培养法
EV 特异	脂蛋白、血小板、裂解蛋白	五组分蛋白框架、蛋白组（miRNA-12 §6）

2.4 含量与制剂（Quantity & Formulation）

蛋白/核酸浓度、颗粒浓度（particles/mL）；
辅料、装量、外观、可见异物。

2.5 稳定性（Stability）

长期/加速/应力条件下结构、纯度、活性变化；
冻融、振摇、光照应力；
EV：储存温度与时间序列的粒径、cargo 回收（miRNA-11 §5.5）。

2.6 生物学「身份」检测（仍属表征，≠药效）

免疫学确认：ELISA、Western、流式表型；
正交表征：至少两种不同原理的技术互证（MISEV2023 要求精神）；
标志物存在/纯度/来源：如 CD63、CD9、CD81 与阴性标志（高尔基、线粒体蛋白应低）。

要点：生物表征证明「每批仍是定义中的那个产品」，不单独等同于「能治病」。

2.7 组学在生物表征中的位置

转录组与蛋白组是生物表征的组成画像（cargo profiling）主力手段，回答「装了什么、纯不纯、批间像不像」——属于 miRNA-11 中的身份与内容维度，不是分子功能中的效价检测。

生物表征（总）
  ├─ 非组学：理化、结构、粒径、ELISA/Western、稳定性…
  └─ 组学（本文 §3–§5 展开）
        ├─ 转录组：RNA cargo 谱、纯度、签名、批间一致
        └─ 蛋白组：蛋白 cargo 谱、标志物、PTM、杂质、批间一致

分析层次	转录组	蛋白组	归属
L1 数据质控	读段质量、比对率、测序深度	鉴定数、FDR、搜库质量	表征（实验是否成功）
L2 身份/纯度 QC	miRNA%、污染 RNA、溶血签名	EV/产品标志蛋白、血浆/胞内污染	表征（像不像目标制品）
L3 组成与批间	表达矩阵、签名相似度、PCA	定量矩阵、批间相关、PTM 率	表征（CQA 候选）
L4 组间比较	差异 miRNA、通路（谨慎解读）	差异蛋白、富集、工艺变更可比	表征为主；若挂钩疗效则涉功能
L5 多组学整合	miRNA–靶–蛋白关联	与转录组联合判读	表征（三角验证）

平台模块与阶段落地见 miRNA-06、miRNA-07、miRNA-14。

3. 生物表征中的转录组分析

3.1 一般关注什么

转录组在生物表征中的首要任务不是「发现疾病标志物」，而是：

技术 QC：测序是否成功、数据是否可用；
生物学 QC：RNA cargo 是否符合制品/供体预期、有无污染；
组成画像：有哪些 RNA、相对丰度如何；
批间一致：不同批次/工艺条件下谱是否可比；
（可选）组间差异：工艺变更、供体变更、稳定性时间点对比。

与分子功能的边界：转录组读出组成与一致性属表征；若差异 miRNA 直接作为临床疗效替代终点或体外功能归因，则进入功能/生物标志物语境，须单独论证。

3.2 按技术路线划分的分析内容

路线	典型样品	生物表征关注重点	常用分析
sRNA-seq / miRNA-seq	外泌体/EV、体液、细胞上清	miRNA 富集度、污染 RNA、溶血/血小板签名、供体签名	读长分布、分层比对、Top miRNA、签名 PCA
mRNA-seq	EV 长 RNA 片段、mRNA-LNP 载荷、细胞系	基因检出、片段化模式、载体/转基因序列确认	比对、计数、覆盖度、目标序列检出
全转录组 RNA-seq	工程细胞、组织来源制品	转录本组成、异常剪接、病毒/载体读段	标准 RNA-seq QC + 目标基因面板
靶向 RNA 检测	放行鉴别、载荷含量	特定 mRNA/miRNA 绝对量	qPCR、dPCR、nanoString

外泌体场景以 sRNA-seq 为主，指标详解见 miRNA-03。

3.3 分层分析内容（由底向上）

第一层：原始数据与预处理 QC

分析项	关注内容	表征意义
读段质量	Q30、接头%、低质量碱基	文库是否失败
读长分布	21–23 nt 主峰（sRNA-seq）	是否像 miRNA 文库
测序深度	总读段、有效读段、重复率	是否足以做组成与 QC
预处理	修剪、长度过滤、去重复（UMI 可选）	保证下游可比

第二层：比对、注释与定量

分析项	关注内容	表征意义
miRNA 比对/定量	miRBase 成熟体计数、mapping rate	RNA cargo 主体组成
分层比对	rRNA、tRNA/tRF、mRNA 片段占比	制备纯度（裂解/游离 RNA）
mRNA 基因定量	基因/转录本计数（mRNA-seq）	cargo 或载荷身份
组成比例	各 RNA 类型%、Top N 列表	批间签名、供体溯源

第三层：生物学 QC 与签名

分析项	关注内容	表征意义
签名一致性	与标定批/PCA 聚类、相关 (r)	是否仍是「同一类制品」
体液/工艺干扰	miR-451a（溶血）、miR-223（血小板）、FBS 对照谱	血浆/培养上清数据有效性
对照比较	vs PBS、EV-depleted、裂解物	污染与背景（MISEV 精神）
重复性	技术/生物重复相关	数据可信度

第四层：归一化、批次与批间可比

分析项	方法	注意
组成 QC	RPM/CPM	看谱形，不作严格假设检验
差异/比较	DESeq2/edgeR	工艺变更、组间对比；须 n≥3
批次监控	PCA、批次 PCA 着色	发现操作/试剂批次效应
批次校正	ComBat 等	QC 判定慎用；差异分析谨慎使用

第五层：深度分析（表征延伸，非默认必做）

分析项	内容	表征 vs 功能
差异 miRNA/mRNA	火山图、FDR 校正列表	工艺变更可比性 → 表征；疾病机制 → 偏研究
靶基因/通路	TargetScan、GO/KEGG 富集	解释 cargo 生物学主题，≠ 效价
与蛋白组关联	miRNA–靶–蛋白相关	多组学三角验证（miRNA-06 T12）

3.4 按研发场景的关注权重

场景	必做分析	选做分析
EV/CGT 制备 QC	L1–L3 全做；L4 重复性	L5 差异（多批次时）
IND 表征包（RNA cargo）	L1–L4 + QC 报告；对照样品	签名库入库
工艺变更可比性	L4 批间 PCA + 差异 miRNA	通路富集辅助解读
液体活检标志物开发	L3 签名 + L5 差异	临床相关验证（跨表征边界）
mRNA-LNP / 核酸载荷	目标序列检出、完整性、杂质 RNA	全转录组背景

3.5 转录组表征交付物（IND 常见）

□ 测序与预处理 QC 图（读长、质量、深度）
□ miRNA%/污染 RNA% 组成表
□ Top miRNA 列表与签名图
□ 与标定批/对照的相关性或 PCA
□ 溶血/血小板等干扰标志评估
□ 重复性统计
□ 结论：合格 / 边缘 / 不合格（及是否进入比较分析）
□（可选）差异 miRNA 表 + 富集摘要（工艺变更场景）

4. 生物表征中的蛋白组分析

4.1 一般关注什么

蛋白组在生物表征中回答：

鉴定 QC：质谱/搜库是否成功；
身份：是否检出预期蛋白（EV 四跨膜蛋白、产品蛋白、HCP 谱）；
纯度：血浆、胞内、实验污染蛋白占比；
结构/修饰：PTM（糖基化、氧化、脱酰胺）——抗体/重组蛋白核心；
定量组成：cargo 或杂质蛋白的相对/绝对丰度；
批间一致：工艺变更、稳定性时间点谱是否可比。

与 Western/ELISA 的关系：组学是全景、发现式；Western 是靶向、放行式——表征报告宜三角互证（miRNA-12 正交原则）。

4.2 按产品类型划分的分析内容

产品类型	蛋白组表征重点	典型关注蛋白/修饰
外泌体 / EV	标志物、污染、cargo 谱	CD63/CD9/CD81、TSG101；白蛋白、载脂蛋白；ESCRT 相关
单抗 / 融合蛋白	序列覆盖、PTM、聚集体相关肽段、HCP	糖型、Cys 氧化、脱酰胺、片段
重组蛋白 / 酶	产品蛋白鉴定、PTM、杂质谱	糖基化、Met 氧化、宿主蛋白
细胞治疗上清 / EV 治疗	分泌蛋白谱、安全性相关蛋白	细胞因子、HCP、培养基蛋白
血浆 / 体液 EV	高丰度蛋白过滤、低丰度 EV 蛋白	白蛋白、Apo 家族 vs 囊泡标志物

零基础实验流程见 miRNA-08。

4.3 分层分析内容（由底向上）

第一层：搜库与鉴定 QC

分析项	关注内容	表征意义
鉴定数	蛋白/肽段数、覆盖度	样品蛋白量是否足够
假发现率	肽段/蛋白 FDR ≤ 1%	鉴定可信度
分数分布	Andromeda/Percolator 分数	搜库质量
运行 QC	保留时间漂移、总离子流	液相/进样是否异常

第二层：身份标志物与五组分框架

对齐 MISEV2023 五组分蛋白框架（miRNA-12 §6）：

组分	蛋白组分析动作	典型标志物
存在（presence）	四跨膜蛋白是否检出、共现评分	CD63、CD9、CD81、TSG101、Alix
纯度（purity）	非 EV/非产品蛋白占比	核蛋白、线粒体蛋白应低
来源（source）	供体相关蛋白谱	细胞类型特异蛋白
共分离（copurification）	血浆/脂蛋白污染	白蛋白、ApoA1/ApoB
非囊泡颗粒（NVEP）	非 EV 颗粒蛋白签名	依样品类型建规则

抗体/重组蛋白另需：产品蛋白覆盖度、理论分子量肽段是否齐全。

第三层：定量矩阵与污染过滤

分析项	关注内容	表征意义
无标记定量	LFQ/DIA 强度矩阵	组成与批间比较基础
缺失率	蛋白检出频率、MNAR 模式	低输入样品常见，影响统计
高丰度过滤	CRAP、血浆高丰度列表	避免白蛋白掩盖 EV cargo
归一化	median/VSN	运行间系统偏差校正
动态范围	最高/最低丰度蛋白	基质复杂度评估

第四层：PTM 与结构表征（抗体/蛋白必做项）

分析项	内容	表征意义
糖基化	糖肽鉴定、糖型相对丰度	CQA、免疫原性风险
氧化/脱酰胺	修饰位点、修饰率	稳定性、储存条件
二硫键/片段	氧化还原、酶切片段	降解与聚集体前体
批间 PTM 趋势	修饰率时间/批次曲线	工艺与货架期监控

第五层：批间一致与组间比较

分析项	方法	场景
批间 PCA / 相关	Pearson、Spearman	常规放行、趋势监测
工艺变更可比性	差异蛋白 + Hotelling (T^2)（可选）	放大、纯化条件变更
差异蛋白	MSstats/limma + FDR	组间/时间点对比
功能富集	GO/KEGG/Reactome	解释组成变化主题（膜运输、ESCRT 等）
蛋白网络	STRING（可选）	模块级变化，二期能力

第六层：多组学与物理指标联动

联动对象	分析内容
转录组	同一样品 miRNA% 与蛋白标志物联合判读（miRNA-07 P11）
NTA	粒径/浓度与 cargo 是否匹配（颗粒有、cargo 无 → 疑空囊泡）
Western	靶向标志物验证组学结论

4.4 按研发场景的关注权重

场景	必做分析	选做分析
EV 制备 QC	L1–L3 + 污染过滤 + 报告	L6 与 miRNA 联合
IND 表征包（蛋白 cargo）	L1–L3 + 五组分框架条目	L5 若抗体管线
抗体 CMC 表征	L1–L4（PTM 核心）+ HCP	差异（强制降解研究）
工艺变更可比性	L5 批间 + 差异蛋白	富集
稳定性研究	L4 PTM 趋势 + L3 定量趋势	差异随时间点

4.5 蛋白组表征交付物（IND 常见）

□ 鉴定 QC：蛋白/肽段数、FDR、分数分布
□ EV/产品标志蛋白检出表与相对丰度
□ 污染蛋白占比（血浆、胞内、CRAP）
□ 定量矩阵与重复性/PCA
□（抗体）PTM 位点与修饰率表
□ 与 NTA/Western/miRNA 的联合判读段
□ 结论：合格 / 边缘 / 不合格
□（可选）差异蛋白表 + 富集（工艺变更场景）

5. 转录组 × 蛋白组：联合表征逻辑

5.1 为何需要联合

单一组学只能覆盖 cargo 的一部分：RNA 与蛋白不同步（转录后调控、囊泡装载选择性、蛋白半衰期差异）。生物表征在 EV 等制品中强调正交验证（miRNA-12 §5）。

5.2 联合判读速查

转录组信号	蛋白组信号	表征解读	建议动作
miRNA% 高、签名一致	标志蛋白阳性、污染低	合格	进入深度分析或放行
miRNA 弱	标志蛋白阳性	边缘（疑空囊泡/RNA 降解）	补 Bioanalyzer、重复提取
污染 RNA 高	胞内/血浆蛋白高	不合格	回溯分离 SOP
miR-451 高（溶血）	—	血浆干扰	重新采血/处理
鉴定数极低	miRNA 正常	蛋白量不足或搜库问题	查上样量、搜库参数
批间 miRNA 漂移	批间蛋白谱漂移同向	工艺/供体变更	可比性报告

5.3 表征包 vs 功能包（组学视角）

包类型	转录组包含	蛋白组包含	不包含
表征 QC 包	L1–L3 + 报告	L1–L3 + 报告	差异、富集（除非工艺比较）
表征深度包	+ L4 批间 + 签名库	+ L4 PTM + 批间	细胞活性、效价
工艺可比包	+ 差异 miRNA	+ 差异蛋白	临床终点
功能包（分子功能团队）	可选标志物 panel	可选分泌蛋白与活性相关蛋白	取代 potency assay

平台建设顺序：先转录组 QC 闭环，再蛋白组 QC 闭环，最后多组学整合——阶段排期见 miRNA-14 §2.3–§2.5。

6. 分子功能包含哪些内容

分子功能描述分子在靶点 → 通路 → 细胞 → 组织各层级的功能性读出，并尽可能建立因果链（MOA）。

6.1 靶点相互作用（Target Engagement）

读出	方法
结合亲和力/动力学	SPR、BLI、ITC
竞争性结合、表位作图	竞争 ELISA、氢氘交换
受体占有率、内化	流式、共聚焦动力学

6.2 生化活性（Biochemical Activity）

酶动力学：催化速率常数 (k_{\mathrm{cat}})、米氏常数 (K_m)、抑制常数 (K_i)；
抗体：Fc 效应（抗体依赖性细胞毒性 ADCC、补体依赖性细胞毒性 CDC 等）；
核酸药：靶 mRNA 降解效率、解链温度（(T_m)）、脱靶杂交谱。

6.3 细胞水平功能（Cell-based Function）

信号通路磷酸化、报告基因、增殖/凋亡/分化；
免疫激活或抑制（细胞因子分泌、混合淋巴细胞反应）；
EV：摄取实验、cargo 在受体胞内的功能读出（miRNA-11 §5.4）。

6.4 效价（Potency）——分子功能的「放行口径」

效价是与预期临床效应相关的定量生物学活性检测，须满足：

可重复：实验室内/室间变异受控；
与剂量相关：剂量–效应曲线；
与 CQA 有逻辑关联：工艺变更后 potency 可比；
与临床有桥接：体外读数与体内疗效/PD 标志物有论证链。

治疗性 EV 常见效价读出：免疫调节、促修复、抗凋亡、血管生成抑制等表型；须配 EV-depleted 对照、热灭活对照（miRNA-12 §9）。

6.5 机制归因（Mechanistic Attribution）

策略	目的
通路抑制剂/敲低	证明效应依赖特定信号
蛋白酶 / RNA 酶处理	区分蛋白介导 vs 核酸介导
分泌抑制（nSMase2、Rab 等）	证明效应依赖 EV 分泌
多浓度 + 时间过程	排除非特异性刺激

6.6 体内功能（常与药效学合并）

药效学（pharmacodynamics，PD）标志物、靶组织分布；
体外 potency 与体内疗效的相关性论证；
体内研究须报告给药剂量、途径、标记方法及对分布/功能的影响（miRNA-12 §10）。

要点：分子功能证明「按预期机制产生足够且可重复的效应」。

7. 二者关系：重叠、分工与常见混淆

7.1 研发阶段对应

靶点发现 / 先导优化
    ├─ 分子功能为主：结合、通路、细胞药效 → 选候选、定 MOA
    ▼
临床前 CMC 开发
    ├─ 生物表征：结构/纯度/稳定性/身份标志物 → 定 spec、CQA
    ├─ 分子功能（效价）：与临床效应挂钩的活性检测 → 批次放行
    ▼
临床与商业化
    表征保证「每批是同一类产品」
    效价保证「每批有足够且一致的活性」

7.2 重叠区：同一实验，两种用途

实验	作生物表征时	作分子功能/效价时
抗原结合 ELISA	确认身份、批间一致性	结合活性定量，与临床剂量换算
细胞杀伤实验	确认产品类型（如 CAR-T 功能存在）	效价放行，建立规格上下限
NTA 粒径/浓度	CQA 趋势监测	功能实验的输入剂量归一化依据
sRNA-seq cargo 谱	批间签名一致性（表征）	标志物与疾病机制（功能假说）

区分标准：看实验首要目的——是证明「仍是同一产品」，还是证明「仍有足够治疗作用」。

7.3 三类常见混淆

混淆	纠正
「有 CD63 就有疗效」	身份标志物属表征；疗效须单独功能/效价证明
「粒径正常即可放行」	物理指标不能单独证明身份或功能（MISEV）
「体外有效即可申报」	须建立 potency 与临床终点的桥接，并配完整 CMC 表征

8. 按药物类型的侧重点

类型	生物表征侧重	分子功能侧重
单抗 / 融合蛋白	糖型、聚集体、电荷变异体、片段	抗原结合、Fc 功能、细胞杀伤/阻断
重组蛋白 / 酶	PTM、比活性相关理化指标	酶活、底物特异性
siRNA / ASO	全长/杂质谱、修饰一致性	靶 mRNA 沉默、KD、脱靶
AAV / 基因治疗载体	衣壳蛋白、空壳率、基因组完整性	转导效率、表达水平
CAR-T / 细胞治疗	表型、扩增、活力、拷贝数	靶细胞杀伤、细胞因子分泌
外泌体 / EV	粒径、浓度、五组分蛋白、核酸/脂质谱、稳定性	摄取、分泌依赖性、免疫/修复等效价读出

外泌体/EV 行与组学展开见 §3–§5；全系列映射见 §9。

9. 与本系列评估体系的映射

miRNA-11 将外泌体评估拆为三维；与本文对照如下：

miRNA-11 维度	主要归属	系列文档
身份（identity）	生物表征	miRNA-12 §5–§7；miRNA-03
内容（cargo）	生物表征（深度画像）	miRNA-06、miRNA-07
功能 / 效价（potency）	分子功能	miRNA-10、miRNA-12 §8–§10

MISEV2023 五核心问题中的「如何表征」→ 生物表征；「功能是否归因于 EV」「体内行为」→ 分子功能延伸。

10. 项目落地 Checklist（速查）

10.1 生物表征（非组学 + 组学）

□ 身份：序列/标志物/正交方法（≥2 种原理）
□ 结构：一级 + 关键高级结构/PTM（按产品类型）
□ 纯度：聚集体、片段、HCP、内毒素等
□ 含量：蛋白/RNA/颗粒浓度
□ 稳定性：代表条件时间序列
□ CQA 与 spec 草案：哪些项用于放行/趋势监测
□ 转录组：读段 QC、miRNA%/污染%、签名、报告结论（§3.5）
□ 蛋白组：鉴定 QC、标志物/五组分、污染%、PTM（若适用）（§4.5）
□ 多组学联合判读（§5.2）

10.2 分子功能

□ MOA 假说与关键通路
□ 靶点结合/生化活性（若适用）
□ 细胞功能 + 剂量–效应 + 时间过程
□ 阴性对照：空白、热灭活、EV-depleted、非 EV 馏分
□ 机制归因：分泌/蛋白/RNA 依赖性
□ Potency assay 草案：与临床/PD 的桥接逻辑
□ 体内分布或 PD（按适应症）

11. 小结

一句话	生物表征	分子功能
动词	画清楚、比清楚	讲清楚、量清楚
对象	产品结构、杂质、稳定性	机制、通路、细胞/体内效应
监管关键词	CQA、spec、可比性	MOA、potency、PD
外泌体系列	身份 + cargo（§3–§4 组学 QC）	摄取、表型效价、分泌归因、体内行为

生物药研发中二者缺一不可：仅有完备表征而无功能数据，无法支撑疗效预期；仅有体外功能而无表征与批次一致性，无法支撑 CMC 放行与工艺变更。组学层面的表征重点见 §3 转录组、§4 蛋白组、§5 联合逻辑；平台建设见 miRNA-14。