结构与建模：只输出待测清单，不输出结论

工序 4 的交付物是排过序的少数待测突变。建模把上一工序的能量语言接到三维坐标上，回答「改哪个残基、改成什么」。原书对应章可能仍在修订，本篇只写建模在方案里的位置，不推导力场。

$图 1　结构预测、$\Delta\Delta G$ 计算与对接都是提议器，测量才是判决$

1. 模型回答的唯一问题

建模要回答的不是「结构好不好看」，而是：

这个替换会让哪一个宏观态的 $G$ 相对另一个态升高或降低多少？

稳定性计算比较折叠与去折叠（去折叠通常被高度简化）；结合计算比较复合物与分离溶剂化组分；催化还要过渡态模型，难一个数量级。选错比较态，再精的分数也在优化另一个项目。

工程上的经验顺序：有配体复合物的实验结构 > 高置信预测 + 实验约束 > 低置信远源模型。预测模型可以找表面盐桥或核填充候选人，不宜单独支撑「新催化机制」叙事。

读模型时同时看：分辨率或 pLDDT、缺失区、寡聚态是否与溶液一致、活性/结合残基是否在电子密度或高置信区内。本目录结构准确度指标文负责「分数怎么读」，此处只要求：拿不准的坐标不要当能量最小值。

稳定化、结合工序里常用的社区工具：

工具	典型用途	它假设了什么
FoldX	单点/少点 $\Delta\Delta G_{\mathrm{unfold}}$	以实验结构为骨架，不做大范围构象搜索
Rosetta	侧链重排、界面设计、部分稳定化	统计势 + 物理项；对采样和权重敏感
分子力场（如 AMBER）	显式/隐式溶剂下的轨迹与能量	时间尺度与采样是否覆盖相关态
对接（如 SwissDock）	配体姿态	蛋白常被写得过硬；可旋转键一多就掉点

FoldX 的分数里除位阻与静电外，还显式包含溶剂化与熵项，这是它能直接输出「稳/不稳」的原因，也是它不能从一级序列白手起家的原因。对接的打分通常混合：蛋白–配体相互作用、双方构象能、去溶剂化。SwissDock 一类方法在可旋转键少、配体大部分被口袋埋住时更可信。

计算设计结合蛋白已有成功先例（如 Rosetta 设计的地高辛配基结合蛋白达到微摩尔亲和），但后续到皮摩尔往往靠定向进化。也有「姿态对了、分子却不结合」的失败：设计位点过柔，晶体看到预想几何，动力学显示它站不住。

段末注释：力场 / 评分函数是把坐标映射到近似 $G$ 的可计算函数，不是热力学测量。相关系数中等、排序前 10 里有几个真命中，就是可用的工程工具；把它写成「已证明稳 3.2 kcal」则越界。

选定比较态（折叠/去折叠，或游离/结合）。
选定起始坐标，检查相关残基是否可信。
只在差分可能发生的区域动手：核、界面、铰链，而不是「全蛋白扫描完再讲故事」。
用两种以上方法或简单物理直觉交叉（电荷是否暴露、空洞是否变大、Pro 是否锁主链）。
提出可测的少数变体，而不是 200 个未排序突变。
表达、测与设计目标同构的量（$T_{\mathrm{m}}$、$K_{\mathrm{d}}$、$k_{\mathrm{cat}}/K_{\mathrm{M}}$），回写模型。

机器学习突变效应模型是同一流程的加速器，前提仍是标签定义正确、划分不泄漏。它不替换第 3 章的态语言。

差分稳定算不准时，方案切到工序 6（定向进化），改用可筛选表型，而不是加更重的打分函数充结果。

只有 AlphaFold 单体模型、要对一个小分子药物做 100 倍亲和，你先补什么实验或计算？
FoldX 报 $\Delta\Delta G=-2.5,\mathrm{kcal,mol^{-1}}$，却测到 $T_{\mathrm{m}}$ 下降。列出三个非「仪器坏了」的解释。
为何催化设计比稳定化设计更常失败？

（1：复合物结构或对接+实验亲和，确认口袋与质子化。2：测的不是可逆变折叠；寡聚态变了；预测结构局部错；pH/缓冲与计算假设不同。3：要同时做对过渡态几何、动力学步和竞争性水解/旁路。）

建模段落交叉见 Chp-5-Stability.pdf、Chp-6-Binding.pdf。FoldX、Rosetta、AlphaFold DB、SWISS-MODEL 是社区常用实现，版本与许可以各自文档为准，本方案不绑定唯一工具链。