结合的交付物是更小的 $K_{\mathrm{d}}$（或按任务要求变得更松）。选择性的交付物是两条路径的比，不是把 $K_{\mathrm{d}}$ 再降一档。原书选择性章可能仍在修订，验收定义已在能量语言工序就位，本篇只写怎么测、怎么改、怎么避免两项互顶。
1. 结合比较的是复合物和两坨水
配体（ligand）是按化学计量、可逆、有选择地粘到蛋白上的物种。结合强度由复合物（双方互相接触）相对游离态（各自被水包着）决定。
$$
K_{\mathrm{d}}=\frac{[\mathrm{P}][\mathrm{L}]}{[\mathrm{P\cdot L}]}=\frac{k_{\mathrm{off}}}{k_{\mathrm{on}}}
$$
$K_{\mathrm{d}}$ 单位是浓度；数值上等于一半位点被占时的游离配体浓度。越小越紧。定义可用平衡透析建立；实验室读出多用 SPR、ITC、荧光滴定，比较的仍是同一对态。
稳复合物或捣乱游离态（例如在将被配体盖住的区域暴露疏水斑），都能加大 $\Delta G_{\mathrm{d}}$。关键仍是差分：游离态的惩罚必须在结合后被解除，否则只是把两条水平线一起抬高。
段末注释：$K_{\mathrm{d}}$ 是解离平衡常数。抗体亲和成熟在体内会撞上免疫学上限；体外工程的目标常常是从「已经不错」推到「非常紧」，用来降剂量或降检出限。
2. 互补性的两句话
- 形状：位点与配体轮廓匹配，才能形成密集范德华接触并挤出水。
- 化学：疏水对疏水，电荷异号相邻，氢键供体对受体。
抗体–抗原界面大约 15–20 个 CDR 残基接触抗原，多数接触是疏水的，双方会做小幅诱导契合。理想情况是双方最低能构象已经互相匹配，不必再付钱给重排。
氢键不是免费的。形成蛋白–配体氢键的同时，要打断水对双方极性原子的溶剂化。溶剂可及的氢键常常划得来；把未配对的极性埋进干燥界面，去溶剂化代价常超过氢键收益，结合反而变差。这是结合设计里最反直觉、也最常算错的一项。
抗体解剖（重链/轻链、Fab/Fc、CDR）只为了指出：动手的地方是接触面及其框架几何，不是随机扫表面。曲妥珠单抗在框架上补突变才找回亲和，是同一几何问题。
3. 计算能走到哪
对接负责姿态；Rosetta 等负责在姿态上改氨基酸。地高辛配基结合蛋白可以被设计到微摩尔，再靠定向进化进皮摩尔——数量级跳跃往往不是一次打分函数能跨过的。设计位点若过度柔性，静态几何正确也会在溶液里散掉。
因此结合项目的诚实分割是：计算负责提出互补性假说（谁该变成更大的疏水、哪对氢键该暴露），筛选负责走完剩余的数量级。
4. 选择性：已经在比两条路径
结合选择性是蛋白对配体 1 与配体 2 的关联常数之比，对应
$$
\Delta\Delta G_{\mathrm{d}}(1\text{ vs }2)=\Delta G_{\mathrm{d},1}-\Delta G_{\mathrm{d},2}
$$
反应选择性同理：两个底物的 $k_{\mathrm{cat}}/K_{\mathrm{M}}$ 之比，或同一底物两个产物的分流。对映选择性是其中被讲得最多的一种。改进选择性是让这个已经存在的 $\Delta\Delta G$ 再变大，能量账上会多一个 $\Delta$。
判决真正目标时不要把选择性误当成反应性：只降低「错底物」的速率、不提高「对底物」的速率，在单底物工业反应器里可能毫无产量收益；在必须抑制旁路或毒性产物时，选择性本身才是目标。
酶选择性工程的结构抓手，常是改口袋形状使一条过渡态更匹配、或改能区分两个对映体的定向氢键。它与结合章共用互补性语言，只是比较对象从「有或无配体」变成「配体 A 对配体 B」。
5. 反应性先挂在这里
「更快的酶」在原书仍修订，方案不单列工序。验收锁一句：反应性比较 $\mathrm{E}+\mathrm{S}$ 与 $\mathrm{E\cdot TS}$。只降 $K_{\mathrm{M}}$、不稳过渡态，可能得到「更亲底物、周转不变或更慢」的酶，不能当催化完成。西格列汀转氨酶从零活力到工艺可用，是反应性项目；稳定与选择是并列约束。
6. 验收
- $K_{\mathrm{d}}$ 从 $10,\mathrm{nM}$ 降到 $1,\mathrm{nM}$，大约对应多少 $\Delta\Delta G_{\mathrm{d}}$（$25^{\circ}\mathrm{C}$）？
- 设计了一对完美的埋藏氢键，ITC 却显示亲和变差。优先怀疑什么？
- 诊断抗体对近缘抗原出现假阳性，你该优化 $K_{\mathrm{d}}$ 还是 $K_{\mathrm{d}}$ 之比？
（1：约 $1.36,\mathrm{kcal,mol^{-1}}$。2：去溶剂化 > 氢键；或氢键几何在溶液中并不如模型里那么直。3：之比——假阳性是选择性失败。）
7. 依据与边界
结合对照 Chp-6-Binding.pdf。选择性章以 开放文本目录 为准；能量定义回工序 3。假阳性是选择性失败，不要用「再降 $K_{\mathrm{d}}$」结项。