预测反复和实验对不上、或机制写不清时，切到本工序：用表型搜索代替猜位点。交付物是与真正目标同构的筛选循环，外加怎么处理多位点（加和、重组、跳跃）。部分原书 DE 章仍可能修订，这里只写能直接开工的骨架。
1. 一轮循环只做三件事
**定向进化（directed evolution，DE）**在实验室重复达尔文循环，但适合度由你的测定定义，不是由生物存活定义：
- 制造多样性：易错 PCR、位点饱和、DNA 改组、盒式突变；
- 筛选或选择：对真正目标对应的表型打分；
- 把优胜者当前一轮亲本，必要时重组。
**选择（selection）**把改进与存活或显示偶联，通量大，但容易筛到「作弊」（表达量、宿主代谢、不再生产有毒产物）。**筛选（screening）**逐个测真实指标，更干净，通量受测定限制。测错量等于进化出另一种蛋白：想要 $k_{\mathrm{cat}}$，却按菌落颜色（其实是表达量）选，会得到高表达的懒酶。
多样性必须落在可表达的骨架上。第 2 章的质粒与开关在这里变成文库载体。文库太大而测定太慢，是 DE 的主约束；所以才有「聪明文库」：只允许同源序列里出现过的氨基酸，降低致命突变比例。
段末注释：筛选给每个变体一个数；选择只让一部分变体活下来。没有与真正目标同构的测定，循环再快也在爬山的另一座峰。
2. 适应度地形：走步还是跳跃
把序列空间画成地形：海拔是你的改进因子。单氨基酸替换是邻格上的一步；同时多个替换是一次跳跃。
- 本地峰：再走一步都下降，单点饱和会困住。
- 谷：两个替换单独有害、合在一起有益——一步走不到，必须跳或先走到过渡基因型。
这就是为什么大改动（辅酶特异性翻转、从零活力到工艺酶）几乎总要多位点。异丙基苹果酸脱氢酶把对 NAD 的 100 倍偏好翻成对 NADP 的 200 倍偏好（约 $2\times 10^{4}$ 倍选择性变化）用了 5 个位点；西格列汀转氨酶换了 27/330 个残基；卤醇脱卤酶换了 35/254。体积产率这类指标本身就是催化、稳定、抑制等多性质的乘积，更不会是一个点突变。
3. 多位点的三条发现路径
3.1 独立有益，直接加和
位点空间上分开、结构扰动小的突变，常近似独立：$\Delta\Delta G$ 相加，性质倍数相乘。稳定化突变尤其如此（Pro 限制的是局部展开熵）。做法：先筛单点，再全部组合。SH3 域三突变的 $\Delta\Delta G_{\mathrm{unfold}}$ 几乎等于三个单点之和，是接近理想的加和。
$\gamma$-葎草烯合酶改产物谱也用了加和模型：先对塑造口袋的 19 个残基分别饱和，再按加和预测组合，把主产物从混合物里拔出来。
3.2 重组，丢掉有害组合
有些单点各自有益，合在一起互相拆台（负协同）。重组（包括 DNA shuffling）在有益单点集合里做子集搜索，删掉坏组合。这是「先发现、再净化」。
3.3 隐藏的有益：多轮累积或同时多突变
有的替换单独看有害或中性，只在第二个替换存在时才有益（正上位性）。来源之一是：功能上有益但 destablilize。亲本太脆，带上它就折了；先把亲本预稳定，这些点才会在筛选里冒出来。
同时多突变文库能直接看见复杂协同，但空间爆炸，且一个强有害突变会盖住同伴的好处。改组与同源约束文库用来降低「致命负荷」。Boder 等对单链抗体做易错 PCR 加片段重组，四轮后最佳变体带 12 处替换、结合提高约 $10^{3}$ 倍——他们并未试图解释每一个点，因为目标是亲和，不是机制论文。
| 策略 | 擅长 | 不擅长 |
|---|---|---|
| 单点饱和 + 组合 | 加和、可解释 | 隐藏协同 |
| 多轮累积 | 逐步揭示条件有益 | 慢；路径依赖 |
| 同时多突变 / 改组 | 跳谷、复杂协同 | 文库与测定压力大 |
| 预稳定再 DE | 放出 destablilize 的功能突变 | 需要先有稳的骨架 |
4. 和预测工序如何交接
DE 不是反结构。饱和谁、改组哪一段，常常来自口袋与铰链的结构假设；打出来的热点再回模型看是稳了过渡态、补了界面，还是只是提高了表达。机器学习可以在有标签的中间轮次提议下一轮文库，但仍服从：标签 = 真正目标，划分不泄漏，湿实验关门。
工业叙事里，西格列汀转氨酶是「预测不够、筛选补完」的代表：起点对工艺酮无活力，且不耐工艺条件；工程同时交付活力、选择与稳定。
5. 验收
- 你的测定把「菌落在底物平板上更大」当成催化改进。可能进化出哪三类作弊？
- 两个单点各快 10 倍，双突变只快 10 倍。这是加和、还是上位性？下一步做什么？
- 为何「先稳后进化」常比「先进化后补稳」更容易？
（1：分泌更多酶、底物被宿主吃掉、突变降低毒性而不是加快目标反应。2：负协同或其中一个在双突变背景中不再有益；做重组扫描。3：许多功能突变的第一张账单是稳定性，预付这笔账才能看见它们。）
6. 依据与边界
多位点对照 Chp-10-Dir-Evol-Mult-AA.pdf；单轮循环以 开放文本目录 第 9 章为准。工业量级见 Savile 等 (2010) 转氨酶、Fox 等 (2007) 卤醇脱卤酶。测定与真正目标不同构时，本工序会稳定地进化出另一种蛋白。