Raygun：模板引导的蛋白微型化、改造与放大

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第三方解读 Devkota / Singh 等 Nature 2026：Raygun 将蛋白语言模型嵌入压缩为固定维概率分布，以两个参数协同控制替换与 indel，实现模板引导的微型化与功能保留；细胞实验验证荧光蛋白、TurboID 与 EGF-EGFR 结合。
项目 内容
题目 Miniaturizing and modifying natural proteins with Raygun
期刊 Nature（2026-07-29，Open Access，CC BY-NC-ND 4.0）
作者 Kapil Devkota、Daichi Shonai（共一）；通讯 Scott Soderling、Rohit Singh（Duke University 等）
DOI 10.1038/s41586-026-10842-8
代码 / 数据 GitHub: rohitsinghlab/raygun；训练数据 Zenodo；设计序列 AddGene

总体来说：Duke 团队提出 Raygun——以现有蛋白为模板，把蛋白质语言模型（Protein Language Model，PLM）嵌入压缩成固定维度的概率分布，再用 noise（替换强度）与 target length（indel 目标长度）两个参数一次性生成可变长候选（相较于大部分设计方案以替换稳住，本方法主要是考虑了indel来改变蛋白长度）；在荧光蛋白、TurboID 生物素连接酶与 EGF–EGFR 结合三条湿实验链路上，部分候选保留了功能，但极端微型化与超高活性工程化性状仍依赖下游筛选或定向进化。

1. 要解决的问题

天然蛋白进化同时依赖点突变与 indel，但现有计算设计大多只能在固定长度上做替换，或走 de novo 从头生成——能否在保留模板结构与功能语法的前提下，对天然/工程蛋白做大规模、协同的替换 + indel，且计算上可并行、可筛选？

更具体地说：给定一条模板序列，能否只调两个标量，就系统性地生成 10–25%（有时 >50%）缩短、或适度放大的变体，并在功能位点（活性中心、发色团、结合界面）上仍保持合理保留率？

2. 现阶段的常见方案

de novo 路线（RFdiffusion、Genie 2、ESM-3 等）擅长从约束出发「造新蛋白」，但长度通常在生成时固定，生成后再改长度往往只能做替换，indel 空间难以系统搜索。

模板引导的替换设计（逆折叠 ProteinMPNN、PLM 嵌入空间采样、inpainting 类 EvoDiff / DPLM）在同长度变体上已较成熟：对单点或局部替换，PLM 嵌入附近采样即可得到功能保留变体。但一旦需要删结构域、缩环区、适配 AAV 包装上限，或在短肽模板上做适度延伸，嵌入维度随序列长度变化，不同长度蛋白的表示不可直接比较，indel 设计在表示层就卡住。

手工结构生物学路线（如 UltraID 删除 TurboID 的 DNA 结合域）能成功，但依赖领域知识指定删哪里；作者希望用数据驱动方式自动找到可删冗余区。

其实也是目前技术实现路径上的一个技术缺口：缺少一种 length-agnostic（长度无关）的模板表示，使「从同一模板出发、任意目标长度、单次采样」成为可 tractable 的设计操作，而不是迭代贪心删残基或固定长度 inpainting。

3. 作者提出的新思路

核心假设：PLM 逐残基嵌入虽随长度变化，但相邻残基信息高度冗余；把序列切成固定数量 $K$ 个 block 并对每 block 做聚合后，可用多元高斯分布近似该蛋白在嵌入空间的「功能–结构语法」，从而把任意长度蛋白映射到同一固定维空间。

设计选择对照直觉：

  • 若假设成立：同一模板在不同 target length 下采样，应仍预测为相似 fold（TM-score 等），且功能位点保留率高于随机 indel 基线。
  • 若假设不成立：缩短/放大后结构指标应随机崩溃，或 indel 会集中破坏活性中心——实验上作者报告功能位点保留比高于整体序列保守比（>1.0）。

Raygun 定位是模板引导设计（template-guided design）：从天然流形上的蛋白出发向外探索，与 de novo「从远处收敛到流形」互补；AAV 载荷、融合标签体积、结构域裁剪等场景，属于「长度错了但其余性质已对」的工程痛点。

Raygun 固定维概率编码示意（科普漫画；非原文图）

段末注释：TM-score 衡量预测结构与模板结构的全局相似性（0–1，越高越像）；后文结构保留讨论默认指 AlphaFold3 / OmegaFold 等预测结构相对模板的 TM-score。

4. 方法与原理

4.1 输入 → 输出

输入 含义
模板氨基酸序列 任意天然或工程蛋白
noise $\sigma$ 缩放高斯协方差，控制替换/序列多样性
target length $L_{\mathrm{out}}$ 目标序列长度，驱动 indel
输出 含义
一条长度 $L_{\mathrm{out}}$ 的候选序列 经 ESM-2 解码器从重建嵌入反推

单次生成在 NVIDIA A100 上约 0.3 s；作者称相对 diffusion de novo 路线约 100× 更快（同文比较口径，非独立基准）。

4.2 固定维概率编码

  1. 用 ESM-2 650M 得长度 $n$ 的嵌入矩阵（每残基 1280 维）。
  2. 划分为 $K=50$ 个等长 block（block 内残基数随 $n$ 缩放，如 500 aa 模板约 10 aa/block）。
  3. 对每个 block 的嵌入向量取平均；由中心极限定理，block 统计量近似多元高斯。
  4. 50 个 block × 1280 维 → 固定 64,000 维表示，与原始 $n$ 无关。
  5. 推理时从该分布采样（noise 控制协方差），再解码到指定 $L_{\mathrm{out}}$。

与 diffusion（EvoDiff、DPLM 等）的差异：Raygun 走单步采样 + 解码器一步去噪，非迭代 denoising；trade-off 是探索方式不同，同长度 benchmark 上作者报告结构/功能保留与 inpainting 方法相当（见 Extended Data Fig. 5f、9b）。

4.3 Raygun 架构（auto-encoder）

  • Encoder：ESM-2 嵌入 → 多级 T-Block（Transformer + 1D 卷积，抓全局与局部）→ Reduction（block 内平均，产出固定长表示）。
  • Decoder：固定长 latent → Repetition（按 $L_{\mathrm{out}}$ 展开为变长嵌入）→ T-Block → 重建嵌入 → 预训练 ESM-2 序列解码器（验证准确率 >99%）。
  • 参数量约 701M；在 UniRef50 ~80k 蛋白上自监督训练（作者亦展示更大数据/更大模型可继续提升）。

训练目标（三轴一致）：

  1. 嵌入空间重建损失；
  2. 序列空间交叉熵（经 ESM-2 解码）；
  3. size-invariance loss：固定长表示 → 解码更短序列 → 再编码 → 惩罚 latent 漂移（保证跨长度生成稳定）。

推理技巧：

  • 一步 recycling：将生成候选再作模板过一遍，提升质量/多样性；
  • decoder 微调：encoder 管多样性、decoder 管保真；对目标家族只微调 decoder 可达 BLOSUM >0.99，且多样性下降有限；
  • 下游过滤：伪对数似然 pLL（PLM 适应度代理）+ 长度校正 pLL（跨长度公平排序）；常配合 HMMER/Pfam、TemStaPro、任务专用 predictor（如 GFP 亮度模型）。

原文 Fig.1 为官方总览（Nature 原文 Fig.1）；本文为 CC BY-NC-ND，此处不转载原图，以上文字对应原文 Fig.1a–h 流程。

5. 主要结果

5.1 计算内：结构与功能语法保留

对 血红蛋白（147 aa）、CCR1（355）、lacZ（1024）、mTOR（2549）（跨度约 17×）各生成 2000 候选，保留 length-adjusted pLL 前 5%：

  • 在 ±10% 长度变化内，中位 TM-score ≈ 0.78；
  • mTOR 缩短 >500 aa（>20%）时 TM-score 仍约 0.7；
  • 更激进设置下可减半或加倍长度、或 >50% 残基替换，结构仍「 broadly 保留」（作者表述，需结合具体蛋白看）。
  • indel 位置：不完全堆在单环区；小幅缩短时略偏 loop，大幅缩短时偏好减弱；α/β 删除比例大致均衡。
  • 功能位点：有注释的活性/结合位点，其保留率相对全序列保守率之比 >1.0（5%/10%/25% 删除率均如此），提示 implicit 偏好 functional site。
  • Pfam 结构域：50–200% 家族长度范围内，50.65% 候选保留结构域；优于匹配 indel/替换率的随机序列基线约 15%。
  • 与 EvoDiff / DPLM 同长度对比（60 个酶，匹配序列同一性分布）：结构保留与 CLEAN EC 预测功能保留相当；Raygun 额外支持 indel。

5.2 湿实验一：微型化荧光蛋白（eGFP / mCherry）

设置：各 70,000 候选，目标长度 195–235 aa；过滤 = pLL（去掉 90%）+ hmmscan（Pfam）+ 自定义亮度 predictor → 8 条实验验证。

指标 结果（相对模板/数据库）
缩短幅度 eGFP 最多 −25 aa（10.5%） → 199 aa；mCherry −37 aa（15.6%） → 206 aa
与 FPbase 比 2 条短于 96% 已知荧光蛋白
细胞荧光 6/8 有明显荧光（XFP01/02/04/05/06/08）；XFP03/07 阴性
发色团约束 未硬性指定 XYG motif 或 Hayes et al. ESM-3 GFP 设计中的 6 残基/58–71 约束；多数仍自发保留发色团；1 条含非经典发色团

对照含义：相对 Hayes et al. Science 2025 ESM-3 de novo GFP（固定 229 aa + 强约束），Raygun 走「更短 + 更弱约束」路线，亮度普遍偏低——与荧光蛋白 narrow fitness landscape（Sarkisyan Nature 2016）一致，作者亦预期需定向进化提亮。

5.3 湿实验二：微型化 TurboID

设置：500,000 候选；moderate 195–235 aa + extreme 150–180 aa；过滤含 TemStaPro、pLDDT、TM-score 等 → 11 条验证。

候选 要点
TurboID-1（317 aa，−1%） 有显著生物素连接活性
TurboID-5（304 aa，−6%） 有显著生物素连接活性
TurboID-11（165 aa，约 −50%） 自发删除 DNA 结合域（与手工 UltraID 策略一致）；可表达但连接活性不显著
表达 6/11 有 HA western 信号

解读：对多结构域、经定向进化强化过的 supra-evolutionary 活性（TurboID 相对 BirA），PLM 统计 alone 不足以保证极端缩短后仍高活性；moderate 缩短更可靠。

5.4 湿实验三：放大 EGF 提升 EGFR 结合（Adaptyv 竞赛）

设置：模板 EGF 53 aa（接近 Raygun 最短阈值 ~50 aa），放大至 55–57 aa；decoder 在 5 条 EGF-like 序列上微调；10,000 候选；用 ProTrek 三模态 PLM 按序列预测 EGFR 结合潜力排序（非 iPTM/iPAE 结构界面指标）。

变体 $K_{\mathrm{d}}$（µM） 相对 WT EGF（0.759 µM）
EGF-Raygun-1 0.274 更强
EGF-Raygun-2 0.561 更强
WT EGF 0.759 —

10 条提交中 4 条进入生物测试，2 条结合更强；作者称在同竞赛 EGF 路线中 $K_{\mathrm{d}}$ 最优。序列同一性更低者（Raygun-1 70.7%）反而更好，改动多在外围位点，提示全局上下文影响结合，非仅界面残基。

段末注释：$K_{\mathrm{d}}$（dissociation constant，解离常数）越小表示结合越强；EGFR（epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体）为 EGF 靶标。

6. 局限、假设与审慎读法

  1. 训练规模：主文模型仅 ~80k UniRef50；超长蛋白（如 mTOR 2549 aa）零样本重建更难，作者建议微调；更大模型/数据改善有 Supplementary 证据，但主结论仍来自中等规模 checkpoint。
  2. 过滤负荷：高 hit rate 依赖 pLL + Pfam + 任务 predictor 等多级筛选；未过滤候选相对 greedy pLL 删残基基线虽更好保留功能位点，但最终实验 hit rate 仍低（荧光 6/8、TurboID 活性 2/11）。不能把「生成器 implicit 保留」等同于「无需实验」。
  3. 指标与真实功能：TM-score、pLDDT、ProTrek 相似度是代理；TurboID-11 说明「结构/interface 预测过关 ≠ 催化效率保留」，尤其对工程化超高活性酶。
  4. 极端缩小：自发删结构域在 TurboID 上与 UltraID 一致，但 50% 缩短丢活性——Raygun 找得到「像那么回事的序列」，不保证「好用」。
  5. 荧光亮度：成功变体多「有荧光但更暗」；与 de novo GFP 类似，需进化/筛选补亮度。
  6. 生物安全：作者签署 Responsible AI for Biodesign 原则；免疫原性、脱靶等治疗场景风险文中仅原则性讨论，未做系统性安全实验。
  7. 许可：代码与数据已开放；文章 CC BY-NC-ND，二次改编图/衍生序列用于商业需另查 AddGene 与许可条款。

7. 其他可对比参考的方法

方案 时间 核心差异 证据类型 何时更值得考虑
EvoDiff / DPLM 等离散 diffusion inpainting 2023–2024 同长度、迭代去噪；mask 指定编辑区 同长度酶功能 benchmark 只需局部替换、不改长度
ProteinMPNN + 结构约束 2022+ 结构条件逆折叠，无 indel 大量结构/design 案例 骨架固定、优化序列/稳定性
Greedy pLL / ESM 删残基 通用 逐位删低 pLL 残基；无全局 indel 协调 文内 eGFP/mCherry/RAS 对照，功能位点保留更差 快速粗缩短、可接受大幅失活
手工结构域删除（UltraID） 2022 领域知识指定删 DNA-binding domain TurboID 172 aa 高活性 已知冗余结构域、要可解释编辑
ESM-3 de novo GFP（Hayes Science 2025） 2025 从头/强约束发色团，非缩短 488 条 de novo 荧光序列 要探索远源序列而非缩模板
RFdiffusion / Genie 2 等 de novo 2023–2024 新骨架/新 fold；长度固定 binder/酶 de novo 无合适模板、需全新几何

Raygun 的差异化在于 indel + 替换同一框架、单次采样、模板保真；若任务仅是 同长度点突变 或 已知删哪一段结构域，上表路线可能更简单、实验 hit rate 更可预期。

8. 对从业者的可操作含义

  1. AAV/融合标签体积：值得用 Raygun 批量生成「略短于包装上限」的载体蛋白/报告基因变体，再用任务 filter + 少量湿实验验证；优先 moderate（10–20%）缩短。
  2. 先跑官方 checkpoint + pLL 排序：GitHub 提供 notebook；注意使用 length-adjusted pLL 跨长度比较。
  3. 酶/探针已是 directed evolution 产物：TurboID 案例表明 >30–50% 缩短需准备进化回路；Raygun 输出适合作 起始库，不是终产物。
  4. 短肽放大（EGF 类）：可对极短模板做 magnification + 家族微调 decoder + ProTrek/结合 assay；外围位点可能带来 affinity 增益，需实验确认特异性。
  5. 与 de novo 联用：de novo 得到正确功能但长度超标时，用 Raygun 作 post-hoc 缩短，比重新 diffusion 更省算力（作者 Discussion 主张，需自行验证具体蛋白）。

9. 小结

  • 问题：固定长度 PLM 设计难以系统做 indel，模板引导的大规模「换 + 删 + 加」缺乏统一表示。
  • 思路：$K=50$ block 高斯压缩 → 固定维 latent；noise + target length 两参数控制生成。
  • 最硬证据：EGF-Raygun-1/2 在 Adaptyv 竞赛中 $K_{\mathrm{d}}$ 优于 WT；荧光蛋白 6/8 有活性且 2 条短于 FPbase 96% 条目。
  • 最要紧边界：极端微型化与 supra-evolutionary 酶活性 不能单靠 Raygun + PLM filter；TurboID-11 可表达但无活性即是反例。
  • 发表后对照：48 小时内无新主线；同长度 diffusion/inpainting 与 de novo 仍是互补而非替代。

10. 参考文献与延伸

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