工序 2 的交付物是可表达、已测序、能复做的变体。不会做分子，设计只是待办。本篇只留链路：控制元件在哪、开关怎么开、突变改的是哪一层。具体试剂以实验室 SOP 为准。
1. 表达是两条机器，不是「基因变蛋白」一步
蛋白质表达（protein expression）分两步：RNA 聚合酶把编码区转录成信使 RNA（messenger RNA，mRNA）；核糖体再按三联体密码翻译成多肽。原核体系（以大肠杆菌为主）在编码区外侧还需要四类信号：转录起点与终点、翻译起点与终点。
| 元件 | 谁认它 | 典型位置 | 不做会怎样 |
|---|---|---|---|
| 启动子（−35 / −10） | RNA 聚合酶 | 起始密码子上游 | 几乎无 mRNA |
| 终止子 | 新生 RNA 的茎环 + U 尾 | 编码区下游 | 转录读穿 |
| 核糖体结合位点（Shine–Dalgarno） | 核糖体 | 起始密码子上游约 8 nt | 翻译弱或无 |
| 起始 / 终止密码子 | 核糖体 | 编码区两端 | 框不对或不停 |
机器比识别基序大：聚合酶和核糖体都会盖住编码区前端一段。所以「只改 CDS、不管侧翼」常得到不可表达的构体。
段末注释：启动子决定谁来转录、转录多猛；RBS 决定核糖体上得勤不勤。产量瓶颈多半在转录，其次拷贝数与 RBS，很少是「细菌不肯折叠」这一句能概括的。
2. 过量表达：换更猛的聚合酶，再加开关
实验室用摇瓶，工业用发酵罐，逻辑相同：指定做哪条蛋白，并把它的产量拉高。三条杠杆：
- 更高效的 RNA 聚合酶。pET 体系用 T7 RNA 聚合酶，比大肠杆菌自身聚合酶大约快 5–10 倍。
- 多拷贝基因。质粒独立复制；复制起点决定拷贝数（pMB1 常见约 15–20 拷贝/细胞）。
- 核糖体结合位点强度。
只拉高、没有开关，会把细胞资源抽干。标准开关是 lac 操纵子：LacI 阻遏蛋白占着 lac 操纵基因（operator）时转录关闭；加入不能被水解的乳糖类似物 IPTG（isopropyl $\beta$-D-1-thiogalactopyranoside）后阻遏脱落，转录打开。
pET21 一类质粒通常带：目的基因、T7 启动子/终止子、lacO、组成型 lacI、抗生素抗性（如 AmpR / $\beta$-内酰胺酶）和复制起点。抗性基因保证培养基里只有带质粒的菌能长。不同 pET 变体主要差在纯化标签：N 或 C 端 His 标签、可切接头、或 GST 等。需要更紧的「关」或可调表达时，常用阿拉伯糖诱导的 pBAD。
段末注释：pET 原义是 plasmid for Expression by T7 RNA polymerase。T7 聚合酶本身由染色体上的溶原噬菌体区段提供（如 BL21(DE3)），质粒只提供 T7 启动子下的目的基因。
3. 定点突变改的是 DNA 密码子
**定点突变（site-directed mutagenesis，SDM）**把选定密码子改成另一种氨基酸（也可插入/删除）。subtilisin 的 Met222Ala：ATG → GCG，去掉硫原子从而抗漂白，同时侧链变小、不堵底物通道。
当代常用反向 PCR（inverse PCR）：一对首尾相接的引物沿环状质粒向外延伸，得到带突变的线性全质粒拷贝；再激酶/连接成环，并用对甲基化模板特异的核酸酶消化亲本。突变做在其中一条引物中部（通常 1–3 个碱基），两条引物 $T_{\mathrm{m}}$ 接近、少形成二聚体。
这与「在已经折叠的蛋白上化学修饰某个残基」不是同一层操作。工程可重复的前提是：突变写进可复制的 DNA，然后每一次表达都得到同一变体。
社区事实标准是 pET + 商业定点突变试剂盒（或 Gibson / Golden Gate 组装）。风险：引物二聚、质粒全长 PCR 引入二次突变、标签影响折叠或活性、过量表达进包涵体。测序验证整段表达盒，不是只看突变位点。
4. 在方案里的位置
- 理性设计产出的是「改哪个密码子」；本篇是把它落到质粒上。
- 定向进化产出的是文库（易错 PCR、饱和突变），表达与筛选仍然走同一套控制元件。
- 没有可溶、可测的蛋白，第 3 章以后的 $\Delta G$ 讨论没有实验对象。
5. 验收
- 加了 IPTG 仍无带，优先查 T7 菌株（DE3）、抗性、诱导温度，还是先改折叠算法？
- His 标签加在 N 端还是 C 端，决策依据是什么？
- 为何「合成整条基因」和「inverse PCR 改一两个密码子」会在项目不同阶段切换？
（1：先查表达链路。2：看末端是否参与活性/分泌、是否有结构域边界。3：多位点或密码子优化时整基因合成更干净；单点验证用 PCR 更快。）
6. 依据与边界
对照 Chp-2-Making-Variant-Proteins.pdf。pET 是社区事实标准，不是唯一实现；pBAD 更适合要「关得死」或滴定表达的任务。SDM 见 Smith 等；subtilisin Met222 见 Estell, Graycar & Wells, J. Biol. Chem. 1985。整段表达盒都要测序，不要只读突变位点。