工程逻辑：用吉布斯能验收突变有没有改对态

工序 3 的交付物是验收语言：立项写下的四类目标，在这里变成「比较哪两个态、能量差朝哪边算赢」。后面建模和筛选都在估计或搜索这条差。没有这一步，FoldX 分数、$T_{\mathrm{m}}$ 和菌落大小会各报各的成功。

$图 1　折叠谷更低或去折叠谷被垫高，都会加大 $\Delta G_{\mathrm{unfold}}$$

1. 态、微态、垒

宏观态（macrostate，常简称 state）是有可测体性质的蛋白形式，例如折叠与去折叠的荧光不同、电泳迁移不同。同一宏观态里有大量微态（microstate）——一条具体构象。宏观态之间共价化学通常不变，变的是构象、溶剂接触和配体接触。

吉布斯能图给出三件事：有哪些态、相对高度、态间垒。相对高度决定平衡：

$$
\Delta G = -RT\ln K
$$

$R \approx 1.987,\mathrm{cal,mol^{-1},K^{-1}}$（或 $8.314,\mathrm{J,mol^{-1},K^{-1}}$）。$298,\mathrm{K}$ 时，$K$ 每差 10 倍，$\lvert\Delta G\rvert$ 大约差 $1.36,\mathrm{kcal,mol^{-1}}$。

垒决定实验时间尺度内能不能走到。低垒：折叠/去折叠在测量窗口内平衡。高垒：更低的态也可能来不及占据（打结、大环铰链、慢构象关闭）。化学步的垒对应速率；酶能降低它，不能改底物–产物的 $\Delta G^{\circ}$。

段末注释：宏观态对应你能写成平衡式的两侧（N 与 D、Ab·Ag 与 Ab+Ag）；微态计数进入熵项。看晶体结构时只看见一种或少数微态，看不见「去折叠有多乱」。

2. 四类性质各比较哪两个态

$$
\Delta G = \Delta H - T\Delta S
$$

焓主要来自静电与范德华（氢键是带部分共价特征的静电）；熵来自主链/侧链自由度与溶剂重排。疏水效应约贡献折叠驱动力的 60%，氢键等约 40%（常用经验分割）。

性质	平衡	工程要的 $\Delta G$ 方向
稳定性	$\mathrm{N}\rightleftharpoons\mathrm{D}$	更大的 $\Delta G_{\mathrm{unfold}}$
结合	$\mathrm{P\cdot L}\rightleftharpoons\mathrm{P}+\mathrm{L}$	更大的 $\Delta G_{\mathrm{d}}$（更难解离）
反应性	$\mathrm{E}+\mathrm{S}\rightleftharpoons\mathrm{E\cdot TS}$	更小的 $\Delta G^{\ddagger}$
选择性	两条结合或两条反应	拉开 $\Delta\Delta G$

差分稳定：替换必须让两个比较态的能量不等量地移动。在抗原界面把 Ala 换成 Phe，可能稳复合物（多了接触）同时不稳游离抗体（多暴露疏水面）——$\Delta G_{\mathrm{d}}$ 增大。同一替换若发生在远离界面的疏水核，两个结合相关态被差不多地移动，亲和不变（但稳定性可能变）。

3. 改进因子与 $\Delta\Delta G$

改进因子是变体与亲本在正确方向上的平衡常数或速率常数之比：

$$
\text{improvement factor}=\frac{K_{\text{variant}}}{K_{\text{original}}}\quad\text{或}\quad\frac{k_{\text{variant}}}{k_{\text{original}}}
$$

稳定性不要直接比 $K_{\mathrm{unfold}}$（它变大等于更易展开），应比 $1/K_{\mathrm{unfold}}$。

性质本身是一个 $\Delta G$；改进是两个 $\Delta G$ 的差：

$$
\Delta\Delta G = \Delta G_{\text{variant}}-\Delta G_{\text{original}}
$$

符号随定义：更稳、更难解离 → 正的 $\Delta\Delta G_{\mathrm{unfold}}$ 或 $\Delta\Delta G_{\mathrm{d}}$；更快 → 负的 $\Delta\Delta G^{\ddagger}$。

选择性已经是两条路径之差（$\Delta\Delta G$）。选择性的改进再减一次，记作 $\Delta\Delta\Delta G$。数清 $\Delta$ 的个数，是为了报指标时分清：你在比「一条反应」，还是「两条反应相对值的变化」。

独立突变的 $\Delta\Delta G$ 可加，对应性质倍数相乘。$25^{\circ}\mathrm{C}$ 下约 $1.4,\mathrm{kcal,mol^{-1}}$ 对应约 10 倍速率或平衡变化；两个独立的同等贡献合在一起约 100 倍。这是后文「先找单点再组合」的能量理由。

4. 相互作用清单（设计时逐项问）

静电（含氢键、盐桥）随距离衰减慢，可以远程扰动能。范德华只在接触距离有意义（建模常截断在 $\sim 10,\text{Å}$）。疏水界面会迫使水形成更有序的网络，放出这些水有利于结合或折叠。增加某一态的微态数目（更柔）会通过 $-T\Delta S$ 降低该态的 $G$。

静态结构画出氢键，画不出柔性。估计 $\Delta G$ 时必须同时问：这个替换让哪个态更松或更紧？

5. 报结果时用的链

替换 → 相互作用与熵 → 各态 $G$ → $\Delta G$ → 性质。 建模负责中间两步；实验负责最后一步。对不上时，先查「是不是同一对态」，再查力场。

6. 验收

$\Delta G_{\mathrm{unfold}}=+10,\mathrm{kcal,mol^{-1}}$ 大约对应多大的 $K_{\mathrm{unfold}}$？1 mg 的 30 kDa 蛋白溶液里，去折叠分子是「没有」还是「测不到但仍有很多」？
为何稳过渡态能加速，稳底物态却可能让 $K_{\mathrm{M}}$ 变好却 $k_{\mathrm{cat}}$ 变差？
结合位点远处的核突变，何时会间接改亲和？

（1：约 $4.6\times 10^{-8}$；仍有大量分子瞬时展开。2：稳底物等于加深起始谷，垒可能相对更高。3：当它改了结合态的构象系综或稳定性，使结合相关微态占比变化。）

7. 依据与边界

对照 Chp-3-Logic.pdf。残基化学不在本工序展开，用同目录「氨基酸残基理化性质」。本篇不规定用哪套力场，只规定验收时比较哪两个态。