1. 四级是地图，分区是工位
蛋白质结构按嵌套层次描述：一级结构（primary structure）是残基共价顺序；二级结构（secondary structure）是主链局部几何（$\alpha$-螺旋、$\beta$-折叠、转角、loop）；三级结构（tertiary structure）是单链整体折叠；四级结构（quaternary structure）是多亚基装配。工程不改「三级」这个词，改的是落在某个工位上的残基。
段末注释：一级到四级回答「这是什么层次的对象」；工位回答「这一段残基在折叠体里干什么」。立项目标写在四类性质上，突变必须落到工位上，两套语言不能混写。
工程常用的工位：
| 工位 | 在分子里是什么 | 动它通常改什么 |
|---|---|---|
| 疏水核 | 埋藏的 $\alpha/\beta$ 骨架与侧链堆积 | 折叠稳定性；改坏则聚集 |
| 溶剂表面 | 相对可及性高的残基 | 溶解度、免疫原性、表面盐桥 |
| 口袋 / 活性位点 | 凹腔及其内衬残基 | 结合、催化几何 |
| 第一壳 / 第二壳 | 直接接触配体的残基 / 撑住第一壳的残基 | 反应性、选择性 |
| 活性 loop / 通道 | 围出口袋或隧道的柔性段 | $k_{\mathrm{cat}}$、$K_{\mathrm{M}}$、对映选择 |
| 结构域与铰链 | 独立折叠块及其连接 | 域取向、融合蛋白间距 |
| 亚基界面 | 链–链接触面 | 寡聚、变构、清除 |
| 末端 / 前肽 | N、C 端及可切前体段 | 表达、标签、成熟切割 |
| 天然无序区 | 无稳定三级的区段 | 调控、降解、接头设计 |
**第一壳（first shell）**是与底物、过渡态或配体直接接触的残基；**第二壳（second shell）**是接触第一壳、不直接碰配体的残基。催化三联体属于第一壳，通常锁死；功能改造更多发生在第二壳和活性 loop。
段末注释：第一壳决定化学接触；第二壳决定第一壳站不站得住。只改第一壳常把酶「改死」；只改表面又常改不到催化。
2. 成熟识别方案：有坐标用注释，没坐标用预测
社区把「认区域」分成两条路径：从三维坐标注释（看到了什么）和从序列预测（倾向是什么）。工程上优先注释，预测只在没有可靠坐标时用，并且必须标成假设。
| 要认的工位 | 成熟方案（社区常用） | 输入 | 输出 | 主要风险 |
|---|---|---|---|---|
| 二级结构 | DSSP / mkdssp（坐标注释）；PSIPRED 等（序列预测） | PDB/mmCIF 或序列 | 残基级 H/E/T/… 或倾向 | 把预测写成 DSSP 事实；缺失 loop 在晶体里「消失」 |
| 核 / 表面 | 溶剂可及表面积（solvent-accessible surface area，SASA）→ 相对可及性（relative solvent accessibility，RSA）；FreeSASA、DSSP ACC | 坐标 | 每残基暴露分数 | 探针半径与参照 ASA 不同，阈值不可混用 |
| 口袋 / 空腔 | fpocket（Voronoi / $\alpha$-球）；CASTp（$\alpha$-shape） | 坐标 | 口袋体积、内衬残基 | 晶体接触造假口袋；溶液构象未覆盖 |
| 底物通道 | CAVER 等隧道算法 | 坐标或轨迹 | 隧道中心线与瓶颈残基 | 静态结构漏掉开关态 |
| 结构域 | Pfam / InterPro（序列家族）；CATH / ECOD（折叠分类） | 序列或结构 | 域边界、折叠类型 | 边界差 5–10 残基就会切错融合位点 |
| 亚基界面 | PDBe PISA | 生物装配坐标 | 界面面积、残基、推测化学计量 | 不对称单位拷贝 $\neq$ 溶液寡聚 |
| 无序 / 柔性 | IUPred、MobiDB；AlphaFold pLDDT；B-factor；氢氘交换质谱 | 序列或坐标 | 无序概率、置信度、交换快慢 | 低 pLDDT 也可能只是「难预测」 |
| 跨膜 / 信号肽 | SignalP、DeepTMHMM | 序列 | 信号肽、跨膜螺旋 | 切错信号肽会毁掉分泌构体 |
| 进化约束 | ConSurf；多序列比对保守性 | 序列（+结构） | 每位点保守色标 | 保守 $\neq$ 绝对不能动；共识突变也有假阳性 |
经验阈值（只作起点，须在本蛋白上核对）：$\mathrm{RSA}<0.20$–$0.25$ 倾向核，$\mathrm{RSA}>0.40$ 倾向表面。催化残基、金属配位、辅因子接触以 UniProt 功能注释或复合物结构为准，不要用口袋体积代替机制。
一站式半理性服务器 HotSpot Wizard 把口袋、通道、柔性、保守性叠在一张图上，并可用 FoldX / Rosetta 滤掉明显不稳的替换。热稳定多点设计常用 FireProt、PROSS：能量项 + 进化共识。它们是「缩小位点」的实现，不是验收。
段末注释：SASA 是残基被溶剂看到的面积；RSA 是它相对该氨基酸完全暴露参照值的比例。DSSP 是基于坐标的二级结构字典，不是序列预测器。
3. 按目标选靶区，不要按「看起来好改」
立项四类目标对应不同工位。优先序是经验规则，不是禁令。
| 真正目标 | 优先动手 | 次优先 | 默认先锁死 |
|---|---|---|---|
| 稳定性 | 表面电荷互补、高 B-factor 表面、共识替换；核内体积互补（窄） | 二硫键 / Pro 限制去折叠；界面加固寡聚 | 催化残基；核内 Pro 插入螺旋；核心改成带电 |
| 结合 | 界面热点、口袋内衬（非催化）、识别 loop | 第二壳撑几何；末端若参与表位 | 只为「看起来更疏水」而改核 |
| 反应性 | 活性 loop、第二壳 | 通道瓶颈（底物进出） | 第一壳催化残基、金属配位，除非目标就是关掉毒性活力 |
| 选择性 | 接触「差别基团」的 loop / 第一壳侧链；通道宽窄与电荷 | 第二壳微调取向 | 为提高选择性而拆掉催化核 |
抗体场景把「识别 loop」写成互补决定区（complementarity-determining region，CDR），框架区支撑环的取向——只搬 CDR 常丢亲和，要补框架。酶场景没有 CDR 这个词，但活性 loop 扮演同类角色。
段末注释：CDR 是抗体直接接触抗原的环。酶里对等的是围出口袋的活性 loop，不是整段表面。
四条不写进任务单就会返工的规则：
- 功能改造先动第二壳和 loop，稳定化先动表面和共识，核最后、且要体积互补。
- 界面不是表面：破坏界面会解聚或丢变构，只有目标就是改寡聚时才当主靶。
- 无序区可以激进（截短、换 Gly-Ser 接头），但先查蛋白酶切位点与调控磷酸化。
- 预测模型的低置信区不要当能量最小值——尤其口袋与 loop。
4. 最小作业（可贴实验记录）
- 写下真正目标（四类之一 + 幅度）。
- 取得坐标：实验复合物 > 高置信预测 + 实验约束。
- 跑一套注释：DSSP、RSA、口袋或 PISA、保守性；需要时再加通道 / 无序。
- 填分区表：每个拟突变残基属于哪一工位、RSA、是否催化 / 金属 / 界面。
- 按 §3 选出 10 个以内优先位点，其余进「不可退化」。
- 把清单交给建模工序（少数替换）或定向进化（饱和这些位点）。
社区方案优先用 HotSpot Wizard / FireProt / PROSS / fpocket / PISA / DSSP，而不是自写几何脚本。应用场景：半理性缩小文库、热稳定多点设计、口袋与界面注释。潜在风险：同源模型局部错 1–2 Å 会把口袋残基认错；PISA 把晶体接触当生理界面；共识突变在表达宿主里可能更不溶。
5. 验收
- 任务是提高对映选择性。有人提交了 20 个核内疏水填充突变。缺的是哪一步？
- 只有 AlphaFold 单体、pLDDT 在口袋处 $<70$，却用 fpocket 圈了「活性位点」。下一步补什么？
- 表面 Lys→Glu 提高了 $T_{\mathrm{m}}$，活力掉了一半。可能动到了哪类工位？
（1：没按目标分区，选择性应先看差别基团接触的 loop / 通道。2：复合物结构或对接 + 实验，确认口袋不是模型幻觉。3：该 Lys 可能是第二壳或底物通道电荷，表面不等于「与功能无关」。）
6. 依据与边界
分区语言对接本方案的四类目标与 $\Delta G$ 验收，不替代稳定性、结合专篇。工具：Kabsch & Sander, Biopolymers 1983（DSSP）；Le Guilloux 等（fpocket）；Krissinel & Henrick（PISA）；Sumbalova 等, Nucleic Acids Res. 2018（HotSpot Wizard 3.0）；Bednar 等（FireProt）；Goldenzweig 等（PROSS）。RSA 阈值因软件与参照态而异，文中 $0.20$–$0.25$ 只是起点。没有与真正目标同构的湿实验，分区表只是待测清单。